2022-2023年山东省A(H1N1)pdm09流感病毒HA、NA基因变异特征分析

目的 了解山东省2022-2023流感监测年度分离的A(H1N1)pdm09亚型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因的变异特征,为流感的防控提供科学依据。方法 从流感监测网络实验室分离的流感毒株中按地市随机选取14株A(H1N1)pdm09亚型流感毒株,以WHO推荐的当季疫苗株为参考进行全基因组测序,并采用荧光法开展神经氨酸酶抑制(neuraminidase inhibition,NI)实验以评估药物敏感性。结果 山东省2022-2023年度分离的A(H1N1)pdm09流感病毒属于6B.1A分支中的5a.2a进化簇,核苷酸序列比对分析显示,HA和NA基因与2021-2023年度北半球疫苗株A/Victoria/2570/2019的亲缘关系较为接近,同源性分别为98.5%~98.7%和98.8%~99.1%。氨基酸序列分析显示,HA蛋白有20个位点发生了氨基酸序列变异,并发现1株病毒可能发生抗原漂移,有3株病毒发生了HA蛋白糖基化位点的缺失。NA酶相关重要位点未发生变异。NI实验显示,所测流感毒株均对抗流感病毒药物敏感。结论 所监测毒株与疫苗株整体同源性很高,但氨基酸存在一定程度变异,今后有必要持续开展流感病毒基因变异特征监测以了解流感流行的风险,以及评价基因变异对流感疫苗和治疗药物效果的影响。

Role of the Na^+/K^+/2Cl^- cotransporter NKCC1 in cell cycle progression in human esophageal squamous cell carcinoma

AIM: To investigate the role of Na+/K+/2Cl- cotransporter 1 (NKCC1) in the regulation of genes involved in cell cycle progression and the clinicopathological significance of its expression in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

新型甲型H_1N_1流感毒株NA基因特征和进化

目的通过对新型甲型H1N1流感毒株神经氨酸酶(NA)基因序列的变异分析,揭示毒株NA基因变异与进化。方法检测广东地区分离毒株NA基因核苷酸序列,同时对全球新型甲型H1N1流感毒株NA基因进行检索下载,采用Lasergene 7.1软件比对和分析NA基因核苷酸和氨基酸序列,结合临床资料分析变异基因进化,同时分析糖基化位点。结果 2009年4-12月69株毒株NA基因16个氨基酸位点置换,占3.41%(16/469);NA蛋白主要置换位点在V106I/H和N248D。毒株GD-801-2009(H1N1)和GD-1202-2009的NA基因明显受到的感染宿主选择性作用,而毒株GD-1-2009的NA基因明显受到的感染宿主负选择性作用。与毒株GD-1-2006(H5N1)NA基因比较,毒株GD-801-2009的NA基因插入Nt145-204,导致H1N1NA蛋白增加第49～68位氨基酸(CNQSVITYENNTWVNQTYVN),其中包括4个糖基化位点。结论广东新型甲型H1N1流感毒株NA基因正向不同方向进化;新型甲型H1N1流感NA蛋白新增4个糖基化位点。

福建省2009年甲型H1N1流感病毒NA基因特征及对达菲的耐药性

目的监测福建省甲型H1N1流感病毒NA基因的变化以及对达菲的耐药情况,为临床诊疗和疾病控制提供参考依据。方法从福建省流感监测网络中随机选取23株甲型H1N1流感病毒,经病毒核酸提取和一步法RT-PCR扩增,获得NA基因片段,双向测定核苷酸序列,分析NA基因序列和重要氨基酸位点特征。结果 23株甲型H1N1流感病毒NA片段基因与A/California/07/2009(H1N1)代表株的核苷酸序列进行比较,同源性高达98.1%以上;23株毒株NA蛋白第275位氨基酸均为组氨酸。结论随机选取的23株甲型H1N1流感病毒NA基因片段保持高度同源并且对达菲仍然敏感。随着国内外达菲耐药株的不断出现,应加强耐药性监测,为制定应对甲型H1N1流感流行措施提供参考。

H1N2亚型猪流感病毒HA、NP、NA、M和NS基因的克隆与序列分析

对3株H1N2亚型猪流感病毒（SIV）：Sw／GX／17／05、Sw／HN／I／05和Sw／GX／13／06的血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M）和非结构蛋白（NS）基因进行克隆和序列分析。结果显示：3株分离毒株HA、NP、NA、M和NS基因之间核苷酸同源性分别为91．3％～98．0％、98．4％～98．8％、97．4％～98．3％、98．8％～99．8％和98．1％～98．4％。遗传进化分析显示：分离毒株与美国分离的三源基因重排HIN2sIV具有较近的亲缘关系；在HA、NP、M和NS基因进化树中，3株分离毒株均位于古典H1N1亚型SIV群，在NA基因进化树中，3株分离毒株则位于人流感病毒群。HA和NA基因推导氨基酸序列分别与代表毒株古典H1N1SIVA／swine／Maryland／23239／1991（H1N1）和人H3N2流感病毒A／BuenosAires／4459／96（H3N2）比较分析显示：HA（95．4％～96．1％）和NA（96．6％～97．2％）具有较高的氨基酸同源性；糖基化位点、抗原位点和受体结合位点（HA）处氨基酸存在一定的差异，这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因克隆及序列分析

采用RT_PCR技术扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/ 3/ 96 (H5N1) (GD3/ 96 )NA基因 ,并对其进行了克隆与测序 ,该苷酸序列测定结果表明 :NA基因全长为 1410bp ,共编码 46 9个氨基酸。其序列与A/Hongkong/ 15 6 / 97(H5N1)、A/Chicken/HongKong/ 2 2 0 / 97(H5N1)、A/Goose/Guangdong/ 1/ 96 (H5N1)及A/teal/Hongkong/W312 / 97(H6N1)分离株核苷酸序列的同源性在88.4%～ 99.0 %之间 ,其相应氨基酸序列的同源性在 89.8%～ 99.2 %之间。氨基酸序列与香港流感分离株氨基酸序列相比 ,在茎部没有出现 19个氨基酸残基的缺失 。

H5N1亚型禽流感病毒NA和NS1蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为了获得检测禽流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白和非结构蛋白(NS1)的抗体,试验采用扩增NA、NA+、NS1和NS1+基因,连接原核表达载体p ET-32a进行原核表达,蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,获得NA、NA+、NS1和NS1+的多克隆抗体血清。结果表明:NA、NA+、NS1和NS1+多克隆抗体血清反应性良好,可以检测NA和NS1自身蛋白,且NA和NA+及NS1和NS1+多克隆抗体血清之间均具有良好的交叉反应。说明基因部分缺失对整个NA蛋白和NS1蛋白的抗原性影响不大。

赣州市2014年新型甲型H1N1流感病毒NA基因特征及耐药性分析

目的分析江西省赣州市2014年新型甲型H1N1流感病毒NA基因的特点,掌握其耐药情况,为临床治疗和疾病控制提供参考依据。方法随机选择17株新型甲型H1N1流感病毒,经核酸提取和one-step RT-PCR扩增NA基因片段,双向序列测定,采用DNAStar5.0和Mage4.0序列分析软件分析NA基因特征以及耐药性位点。结果 17株毒株的NA基因片段与代表株A/California/07/2009(H1N1)的序列核苷酸序列进行比对,核苷酸序列同源性高达98.4%以上,氨基酸的同源性也高达97.0%以上。17株毒株的NA活性中心位点氨基酸及周围的辅助位点氨基酸均未发生氨基酸替换。结论 17株毒株的NA基因片段保持高度的同源性并均对流感病毒神经氨酸酶抑制剂药物敏感,但仍应加强对流感病毒的耐药性监测,为制定新型甲型H1N1流感的防制措施提供技术支持。

siRNA沉默NHE1基因对MHCC97-H肝癌细胞侵袭迁移的影响

目的:探讨RNA干扰沉默NHE1基因后对人肝癌细胞株MHCC97-H细胞侵袭迁移的影响.方法:应用NHE1基因小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.转染成功后采用RT-PCR和Westernblot分别从基因和蛋白水平检测RNA干扰沉默NHE1基因的效果.MTT法测定转染后三组细胞的增殖状况,Transwell小室检测沉默NHE1基因对MHCC97-H细胞侵袭、转移能力的影响,进一步采用免疫荧光观察其对MHCC97-H细胞骨架和伪足的影响.结果:与两对照组比较,转染NHE1-siRNA组NHE1mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);细胞侵袭、迁移实验结果显示,NHE1-siRNA组穿透人工基底膜的细胞数(34.1±5.2,120.2±12.8)较空白对照组(56.9±6.1,235.2±16.8)和转染无关对照组(57.2±6.1,231.9±14.7)均明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05),而空白对照组与无关对照组比较差异无统计学意义;MTT结果显示,转染后48h和72h三组细胞间增殖活性差异无统计学意义;NHE1基因沉默后与两对照组相比,MHCC97-H细胞膜伪足形成减少,细胞内肌动蛋白网排列紊乱.结论:siRNA沉默NHE1基因后可能通过影响MHCC97-H细胞骨架的重组和伪足的形成,从而抑制MHCC97-H细胞的侵袭和迁移能力.

人NHE-1基因miRNA干扰载体构建、鉴定及干扰效应评价

目的构建人钠氢交换蛋白-1(NHE-1)基因的miRNA特异性干扰表达载体并转染293细胞,筛选其有效性。方法设计4对miRNA oligo,依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/neg-miR,并转染293细胞,经Re-al-Time PCR评价干扰效应,筛选出干扰效应最佳的靶序列。结果测序证实目的片段正确插入载体中,成功构建4个人NHE-1基因miRNA干扰载体;Real-Time PCR证实完成干扰效应评价,并根据NHE-1基因转录调控区及其蛋白分子结构功能区评价结果,得到NHE1-4是最佳干扰片段。结论成功构建针对人NHE-1基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续NHE-1基因腺病毒miRNA表达载体的构建及其在调控APP裂解相关酶类的功能研究奠定了基础。

Fas和FasL在Na^+/H^+交换器-1抑制诱导缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡中的作用

目的探讨Fas、FasL在Na+/H+交换器1(NHE1)抑制所诱导的缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡中的作用。方法将转染NHE1特异性核酶基因的大鼠PASMCs置于缺氧条件下(O2的体积分数低于1%)培养。缺氧培养2、6、12、24和48h后用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况;半定量逆转录聚合酶链反应(sqRTPCR)方法检测细胞内fas和fasLmRNA表达变化;免疫细胞化学法检测细胞内Fas和FasL蛋白表达变化。结果转染NHE1特异性核酶基因的大鼠PASMCs在缺氧培养时,其细胞凋亡率随缺氧时间的延长而逐渐升高,但细胞内fas、fasLmRNA及Fas、FasL蛋白表达与对照组细胞比较差异均无显著性。结论Fas/FasL死亡通路可能不参与NHE1抑制而诱导缺氧大鼠PASMCs凋亡的调控。

黄瓜质膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。

H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用

为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。

NHE1 mRNA在肝癌组织的表达及意义

目的探讨钠氢交换蛋白1(NHE1)mRNA在原发性肝细胞肝癌组织及癌旁组织的表达及意义。方法采用RT-PCR检测诊断为HCC患者34例的肝癌及癌旁组织中NHE1 mRNA的表达情况。结果所有肝癌组织和癌旁组织NHE1均有表达,相对表达量分别为2.892±0.882和0.802±0.206,两者存在显著性差异(P<0.001)。作为对照的21例肝组织NHE1的相对表达量为0.872±0.186。肝癌组织与对照肝组织比较存在显著性差异(P<0.001);癌旁组织与对照肝组织比较差异无统计学意义(P>0.10)。将从同一患者取材的肝癌组织和癌旁组织检测到的NHE1 mRNA的表达量进行配对t检验,两者间存在显著性差异(P<0.001)。结论NHE1 mRNA在肝癌组织的表达增高,可能在肝癌的发生中起一定的作用。

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。

Na^+/H^+交换泵1激活与心肌肥大

钠氢交换泵 1介导缺血及再灌流引起的心肌损伤。近期的研究提示钠氢交换泵 1也介导长期不良刺激引起的心肌肥大和心衰。钠氢交换泵 1可能是引起心肌肥大的多种因素信息传导下游区的共同媒介 ,比如血管紧张素Ⅱ ,肾上腺α1、β1受体兴奋等。抑制钠氢交换泵 1可能会成为防治心衰的一种新方法。

宁夏2011-2012年甲型H1N1流感病毒NAI耐药性研究

目的调查宁夏流行甲型H1N1流感病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药情况,为抗病毒治疗提供一定参考。方法选取2011-2012年宁夏流感监测分离到的40株甲型H1N1流感病毒,通过NA基因测序分析其重要氨基酸位点变异情况,同时选取9株毒株使用化学发光法进行奥司他韦和扎那米韦两种药物的敏感性测定,分析其耐药情况。结果基因耐药结果表明,40株甲型H1N1流感病毒NA基因发生变异的氨基酸位点分别为M19I、T60N/T、V106I、V241I、N248D、N369K、N386S和D451G,未发现第275、294、152和119位氨基酸发生变异;生物耐药结果表明,奥司他韦和扎那米韦两种药物对选择的9株毒株为正常抑制。结论神经氨酸酶抑制剂类药物对宁夏流行甲型H1N1病毒均敏感,可以继续用以临床治疗,但随着抗病毒治疗病人的增加和病毒的自身变异,应加强耐药性监测以提供及时准确的耐药信息。

糖基化终末产物所致大鼠肾皮质损伤与Na^+/H^+交换蛋白1关系的探讨

目的观察Na+/H+交换蛋白1(NHE-1)抑制剂cariporide对糖基化终末产物(AGEs)所致肾皮质损伤的影响,探讨NHE-1在AGEs所致肾损伤中的作用。方法参考文献方法制备肾皮质薄片,用外源性AGEs与肾薄片在DMEM培养液(37℃,95%O2和5%CO2)孵育120 min,以乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽(GSH)活性和NHE-1表达为指标,观察NHE-1抑制剂cariporide、anti-RAGEs对AGEs所致肾皮质损伤的影响。结果AGEs能明显上调肾皮质NHE-1表达,使肾皮质中MDA含量和孵育液中LDH漏出率分别升高2.2倍和2.4倍(P<0.01),GSH活性降低3.5倍(P<0.01);Cariporide(0.1、1μmol.L-1)能显著抑制AGEs引起的这些变化(P<0.01)。anti-RAGE也能明显阻断AGEs对肾皮质的损伤作用(P<0.01)。结论AGEs引起的肾皮质损伤主要是通过与受体RAGE结合所导致,NHE-1激活可能参与了AGE-RAGE反应引起肾损伤。

H5N1禽流感病毒NA基因重组腺病毒表达载体的构建

构建携带有H5N1亚型AIV NA基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究AIV中NA基因在病毒致病过程中的作用及相关诊断试剂的开发提供依据。采用PCR的方法从构建好的包含有H5N1AIV NA基因的pMD-19T-N1质粒中扩增出NA基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-N1,将pAdeasyd-N1经pacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有NA基因的腺病毒pAd-N1。结果表明,构建含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-N1和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-N1经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-N1转染HEK293细胞,成功获得腺病毒pAd-N1载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。