线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分诱导KG1a细胞凋亡中的作用

目的研究线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分(naja naja actra venom component,NNAVC)诱导KG1a细胞凋亡过程中的作用。方法以人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞为研究对象,采用Annexin V-FITC/PI荧光染色法进行凋亡细胞的形态学观察,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的活性,ELISA法检测胞质内细胞色素C的表达水平,流式细胞仪分析TRAIL死亡受体(DR4、DR5)和诱骗受体(DcR1、DcR2)的改变。结果 NNAVC作用后,荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞,细胞凋亡率随药物作用浓度的增加而升高;Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3蛋白被激活,胞质内细胞色素C的表达明显增加;流式细胞仪检测结果显示,NNAVC具有降低死亡受体DR4和诱骗受体DcR1的表达率,而提高DR5和DcR2的表达水平的作用。结论线粒体凋亡通路和死亡受体通路均参与NNAVC诱导KG1a细胞凋亡的过程,这可能是NNAVC发挥抗白血病作用的机制之一。

中华眼镜蛇蛇毒组分C诱导白血病细胞凋亡作用的研究

研究眼镜蛇蛇毒组分Ｃ诱导白血病细胞凋亡的作用及机制。方法：应用光学显微镜、透射电镜、脱氧核糖核酸（ ＤＮＡ）电泳、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）等方法，观察白血病细胞经过眼镜蛇蛇毒组分Ｃ处理后，形态学、生物化学及ＢｃＩ－２／Ｂａｘ基因表达水平的变化。结果：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导人粒细胞白血病细胞系（ＨＬ６０）发生凋亡形态学和生物化学变化；流式细胞议分析发现眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能使一定比例的人粒单细胞白血病细胞系（Ｊ６－１）、人红白血病细胞系（Ｋ５６２）、ＨＬ６０。细胞及取自患者骨髓的白血病细胞发生凋亡，而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加；ＲＴ－ＰＣＲ方法检测发现眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能使ＨＬ６０细胞Ｂｃｌ－２基因的表达下调，而Ｂａｘ变化不明显。结论：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导白血病细胞发生凋亡，此作用与Ｂｃｌ－２基因的表达下调有关。

中华眼镜蛇毒对K562和难治性白血病细胞体外作用的研究

目的:探讨中华眼镜蛇毒(Naja Naja Actra Venom,NNAV)抗白血病作用。方法:应用不同剂量NNAV和阿霉素(THP)于人红白血病细胞株(K562)和难治性白血病细胞株,观察NNAV直接或协同THP的细胞毒性及采用流式细胞仪进行凋亡检测。结果:NNAV对K562有明显的细胞毒及促进细胞凋亡作用,并剂量依赖地增强THP杀伤作用。但对难治性白血病细胞株作用不一:单用NNAV有细胞毒性25%(5/20);单用无效联合THP有效55%(11/20),以NNAV 100μg/ml+THP 5μg/ml作用最强;凋亡百分率增多60%(12/20)。临床对比研究结果,体外实验THP及NNAV无效的9例病人,含蒽环类全部无效(其他机制药物有效3例);THP及NNAV有效的5名病人,含蒽环类缓解2例,1例其它药物缓解;双相吻合率超过60%。结论:NNAV体外对难治性白血病细胞株有一定杀伤作用,和适当剂量THP合用有效率及杀伤作用明显增加,提示蛇毒中可能含有特殊抗难治性白血病的组分。

中华眼镜蛇毒组分C抗白血病作用的实验研究

目的 :研究眼镜蛇毒组分C对白血病细胞的直接作用及机制。方法 :应用MTT、DNA电泳、流式细胞仪、RT_PCR等方法 ,观察眼镜蛇毒组分C对HL6 0等 9株白血病细胞系的毒性作用、量效关系及白血病细胞经过眼镜蛇毒组分C处理后的生物化学、Bcl - 2 /Bax表达水平变化。结果 :眼镜蛇毒组分对 9株人白血病细胞系均有明显的抑制作用 ,IC50 为 0 .0 0 4 6～ 4 .4 0 μg/ml,且呈较好的量效关系 (r为 0 .6 6～ 0 .99)。眼镜蛇毒组分C能诱导HL6 0细胞发生凋亡生物化学变化 ;流式细胞仪分析发现眼镜蛇毒组分C能使一定比例的J6_1、56 2、HL6 0细胞发生凋亡 ,而且凋亡率随蛇毒浓度的增高而增加 ;RT_PCR方法检测发现眼镜蛇毒组分C能使HL6 0细胞Bcl_2基因的表达下调 ,而Bax变化不明显。结论 :眼镜蛇毒组分C对多种白血病细胞株均具有较强的抑制作用 ;此种抑制作用与剂量呈正相关。眼镜蛇毒组分C能诱导白血病细胞发生凋亡 ,此作用与Bcl_2基因的表达下调有关。

中华眼镜蛇毒对K562/ADM和难治性急性髓性白血病细胞作用研究

目的:探讨中华眼镜蛇毒(NNAV)对人红白血病/阿霉素细胞(K562/ADM细胞)及原代难治性急性髓性白血病细胞的作用。方法:以K562/ADM细胞及10例急性髓性白血病(AML)患者的原代初发难治性急性髓性白血病细胞为研究对象进行实验,应用不同剂量的NNAV作用于细胞后,采用噻唑蓝实验法(MTT)测定细胞增殖情况,免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白Bcl2表达,流式细胞仪测定凋亡率,蛋白质印迹法检测Caspase-3表达。流式细胞仪检测NNAV对细胞周期的影响,检测原代初发难治性急性髓性白血病细胞细胞周期蛋白D(Cyclin-D)的表达情况;观察以上指标在Cyclin-D阳性表达组和阴性表达组有无差异。结果:经过不同浓度的NNAV处理后,无论是K562/ADM细胞还是初发难治性急性髓性白血病细胞,Bcl-2表达下调,Caspase-3表达上调;细胞增殖抑制明显,并具有时间依赖性及剂量依赖性。流式细胞仪检测证实0.8 mg/L和1.0 mg/L的NNAV均能够使原代初发难治性细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期,而处于G2/M期的细胞含量减少。10例原发难治性急性髓性白血病细胞中Cyclin-D表达阳性7例,Cyclin-D表达阴性3例,但以上指标在Cyclin-D阳性表达组和阴性表达组无显著差异。结论:NNAV在体外可明显抑制K562/ADM细胞和原代初发难治性AML细胞增殖;调节细胞周期停滞于G0/G1期,减少G2/M期的细胞含量,提示NNAV有可能通过干预Bcl-2、Caspase-3表达而诱导细胞凋亡,细胞周期进程可能是中华眼镜蛇毒组分对原发难治性AML细胞的发挥增殖抑制作用的机制。

中华眼镜蛇毒组分联合活化免疫细胞对白血病KG1a细胞的杀伤作用

本研究旨在探讨中华眼镜蛇毒组分(Naja Naja Actra Venom Component,NNAVC)与活化免疫细胞联合对人急性髓系白血病系KG1a细胞的杀伤作用。采用CCK-8法检测不同浓度NNAVC对KG1a细胞的杀伤作用,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒测定活化免疫细胞对KG1a细胞的细胞毒作用、NNAVC与活化免疫细胞联合杀伤KG1a细胞以及NNAVC作用后存活的KG1a细胞对活化免疫细胞的杀伤敏感性变化。结果显示,NNAVC对KG1a细胞的抑制率随药物浓度的增加而增高,而活化免疫细胞对KG1a细胞的杀伤活性随效靶比的升高(6.25∶1、12.5∶1和25∶1)分别达到12.30%、24.85%和52.26%。NNAVC与不同效靶比(10∶1、20∶1)的活化免疫细胞联合,对KG1a细胞的杀伤率达到56.21%和85.59%,高于两因素各自的单独作用效果。以不同浓度NNAVC杀伤后存活的KG1a细胞为靶细胞,活化免疫细胞对其杀伤活性在效靶比为10∶1时分别为25.65%、31.33%、28.63%和16.78%,在效靶比为20∶1时分别为40.62%、44.70%、44.62%、40.72%。结论:NNAVC与活化免疫细胞在体外均可以有效杀伤KG1a细胞,二者联合应用能够增强对KG1a细胞的杀伤作用。

中华眼镜蛇毒组分诱导人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞凋亡的研究

目的：探讨中华眼镜蛇毒组分（najanajaactravenomcomponent，NNAVC）诱导KG1a细胞凋亡及相关机制。方法：以NNAVC作用人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞，台盼蓝拒染法测定细胞毒性，流式细胞仪测细胞凋亡率，RT—PCR测细胞凋亡相关基因（Bax、Bak、Bcl-2）的表达。结果：NNAVC对KG1a细胞有显著的细胞毒性作用，能诱导KG1a细胞凋亡，促凋亡作用可能与Bcl-2表达下调和Bax表达上调有关。结论：NNAVC通过调节抗／促凋亡分子诱导KG1a细胞凋亡．提示NNAVC具有治疗复发难治性白血病的应用前景。

体外观察中华眼镜蛇毒组分对KG1a细胞增殖抑制作用及对其细胞周期的影响

目的:探讨中华眼镜蛇毒组分(NaiaNaiaActravenomcomponent,NNAVC)对KG1a细胞的增殖抑制作用及对其细胞周期的影响。方法:以人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞为研究对象进行实验。应用不同剂量的中华眼镜蛇毒组分作用于KG1a细胞后,采用MTT法测定其对KG1a细胞的生长抑制作用,倒置显微镜镜下观察药物作用前后细胞形态学变化,流式细胞仪检测中华眼镜蛇毒组分对KG1a细胞周期的影响。结果:中华眼镜蛇毒组分可以明显的抑制KG1a细胞的增殖。在0.7μg/mL至1.2μg/mL的浓度范围内,中华眼镜蛇毒组分作用具有时间依赖性及剂量依赖性。显微镜镜下观察KG1a细胞经中华眼镜蛇毒组分作用6h后状态开始发生变化,随着药物作用时间的延长,细胞逐渐出现体积变小、变形、胞内空泡、细胞固缩等形态学变化。流式细胞仪检测证实中华眼镜蛇毒组分作用后,能够将KG1a细胞阻滞于细胞周期的G_0/G_1期,而处于G_2/M期的细胞含量减少。结论:中华眼镜蛇毒组分对KG1a细胞的增殖具有明显抑制作用,调节细胞周期停滞于G_0/G_1期,减少G_2/M期的细胞含量,提示影响细胞周期进程可能是中华眼镜蛇毒组分对KG1a细胞的发挥增殖抑制作用的机制之一。

中华眼镜蛇毒组分C对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用

目的:研究中华眼镜蛇毒组分C(FC)对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。方法:采用MTT比色法、生长抑制实验、集落形成实验,探讨FC对小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。结果:FC对B16细胞有明显的毒性作用,处理细胞48h,其IC50=1.75μg/ml。FC处理B16细胞24、48、72h后,各时间点的细胞存活数随FC的浓度升高而减少,细胞的生长受到抑制。FC还显著抑制B16细胞的集落形成,当FC浓度为0.5、1.0、2.0μg/ml时,其抑制率分别为33.42%、50.57%、77.34%。结论:中华眼镜蛇毒组分C对B16细胞具有明显的细胞毒性和生长抑制作用。

中华眼镜蛇毒组分C与传统化疗药物体外抑制人胶质瘤株作用的对比研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分C(FC)体外对人胶质瘤细胞株U251的抑制作用。方法培养箱孵育U251与正常人胶质细胞;加入不同浓度的FC、阿霉素(ADM)和尼莫斯汀(ACNU)。采用细胞毒实验(MTT法),通过细胞生长抑制率评价FC、ACNU和ADM的细胞毒作用。结果FC对胶质瘤细胞的抑制作用突出,24h和48h的IC50分别为2.95μg/ml和2.21μg/ml,而ADM与ACNU远未达到此抑制率。FC对正常胶质细胞的24h、48hIC50分别为8.60μg/ml和6.61μg/ml,两细胞株间存在显著性差异(P<0.05)。结论人胶质瘤细胞对FC的细胞毒性作用是敏感的。FC对胶质瘤细胞的抑制作用优于ADM和ACNU。

中华眼镜蛇毒对人鼻咽癌等抑瘤作用的实验研究

目的：为了探讨中华眼镜蛇毒（NNAV）对鼻咽癌（NPC）等抑瘤作用。方法：用MTT法检测NNAV对人高、低分化鼻咽癌细胞株（CNE－1，CNE－2）、慢性红白细胞血病（K562）和鼠肝癌（Hep－2）细胞株的体外细胞毒作用；同时在裸鼠异体移植性人CNE－2肿瘤模型观察NNAV对NPC的抑瘤作用。结果：NNAV对4种体外培养的肿瘤细胞均有明显细胞毒效应，NNAV对上述细胞的作用24IC50；分别为79μg／ml，75μg／ml，5．5μg／ml和65μg／ml，其中以红白血病最敏感；NNAV对肿瘤细胞株CNE－1和CNE－2的细胞毒作用呈明显时效关系。NNAV对荷人NPC裸鼠有明显的抑制作用，抑瘤率28．75％－60．13％，呈明显量效关系。结论：在体内外NNAV对NPC等均有抑瘤作用。