两种新型快速检测猪SP-A基因方法的建立及对比

为了研究如何提高SP-A基因表达量的检测效率,试验建立了实时荧光定量PCR法以及纳米金PCR方法,根据猪表面活性蛋白A(SP-A)基因的mRNA序列(NM_214265.1)设计并合成引物及配套TaqMan探针,采用猪SP-A基因CDS区全序列连接pMD-18T载体构建新质粒pMD-SPA为阳性标准品,扩增方程为:Y=-3.375X+40.41,扩增效率为98%,R2达到0.999,Ct值批内变异系数及批间变异系数都小于3%。标准品的Ct值与模板的起始浓度有良好的线性关系,最低检测浓度可达2.53×101copies/μL,沿用上述引物建立了纳米金PCR方法,摸索了该方法的最佳反应条件,并对其灵敏度进行了测定。结果表明:钠米金PCR法亦能扩增得到与试验设计相符的特异性条带,灵敏度与荧光PCR方法相当。

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^(-7)ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^(-10)ng/μL,敏感性提高了1000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。

水牛角中含巯基肽类成分的富集及抗氧化、抗炎活性研究

目的富集水牛角Bubali Cornu中含巯基肽类成分(thiols-rich peptide fractions,SHPF)并探讨其抗氧化、抗炎活性。方法通过巯基亲和树脂Thiopropyl Sepharose 6B从水牛角提取液中富集得到SHPF,并采用Ellman法测定游离巯基(-SH)含量;应用单因素实验法优选富集工艺;基于Nano LC-MS/MS技术鉴定SHPF。体外通过H_(2)O_(2)诱导小鼠脑微血管内皮细胞bEnd3氧化损伤,采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测SHPF抗氧化活性;通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症损伤,采用实时荧光定量PCR法测定炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌。结果优化SHPF富集工艺为上样量10μmol游离-SH、吸附时间1 h、洗脱剂为含β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-Me)洗脱剂。从水牛角富集液中共鉴定到704条肽段,其中154条含半胱氨酸(cysteine,Cys)肽段,占总肽段的21.9%,主要来源于角蛋白和角蛋白相关蛋白。体外细胞实验结果表明,SHPF能够提高氧化损伤bEnd3细胞的存活率,同时降低其LDH的泄露,并减少炎症损伤RAW264.7细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌。结论采用优选富集工艺能明显提高SHPF的富集效率,SHPF具有良好抗氧化和抗炎活性,为水牛角“清热解毒”功效物质基础的研究提供了研究思路和方向。