Effect of cytokines on the efficiency of gene transfer into murinehematopoietic progenitors

Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｏｎｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｔｏｍｕｒｉｎｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ￥（杨建民）（宋献民）（卢大儒）（闵碧荷）（李川晟）（孟沛霖）ＹａｎｇＪｉａｎｍｉｎ；Ｓｏ...

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo^R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.

应用X线照射后的Balb/c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的:探索用SPF级Balb/c小鼠经X线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法:实验组小鼠分别经X线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞尾静脉注射2×106个/只。对照组不予特殊处理。结果:实验组在接种5-7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组(P<0.01)。体重较对照组显著下降(P<0.05)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论:Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。

细胞因子对小鼠造血祖细胞基因转移效率的影响

目的：观察细胞因子对逆转录病毒载体介导的ＮｅｏＲ基因在小鼠造血祖细胞及人Ｋ５６２细胞中基因转移效率的影响，以探求最有效地促进造血细胞基因转移的细胞因子或其组合。方法：白细胞介素１α（ＩＬ－１α）、白细胞介素３（ＩＬ－３）、干细胞因子（ＳＣＦ）作用下预培养的骨髓细胞用含病毒颗粒的上清转染后，经Ｇ４１８或不含Ｇ４１８体外半固体培养，以生物学方法及ＰＣＲ方法检测造血祖细胞的某因转移效率。结果：ＩＬ－１α／ＩＬ－３／ＳＣＦ联合应用能最有效地提高小鼠ＣＦＵ－ＧＭ基因转移效率，使转移效率从（６．０４±１．３４）％提高到（４３．６±５．９４）％；ＳＣＦ单独应用能最有效地促进Ｋ５６２细胞基因转移，使其转移效率从（１９．０４±１．５８）％提高到（５４．４６±２．１３）％。结论：ＩＬ－１α／ＩＬ－３／ＳＣＦ联合应用可提高造血干、祖细胞基因转移效率，ＳＣＦ可用于急性髓性白血病患者自体骨髓移植时基因标志的临床研究。

波氏假丝酵母启动子的克隆及新霉素基因的表达

报道了波氏假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）启动子的克隆，将克隆的启动子与 Ｎｅｏ基因重组构建了 含Ｎｅｏｒ基因的表达载体ＹｅｐＮＰ１８１，转化波氏假丝酵母，实现了Ｎｅｏｒ基因在波氏假丝酵母中的表达，使波氏 假丝酵母转化子能在含Ｇ４１８的抗性培养基上生长从而建立了Ｎｅｏｒ基因──Ｇ４１８选择系统，为外源基因在 波氏假丝酵母中表达创造了条件．

逆转录病毒载体介导Neo^R基因转入正常人造血祖细胞

本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo^R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,经含G418(1000μg/ml)体外半固体培养,可见具有抗性的CFU-GM集落生长。应用PCR方法检测转染细胞中neo^R基因的转移和表达,在生产逆转录病毒的辅助细胞株PA317/N2及体外液体培养的骨髓细胞中均可扩增出neo^R基因的DNA片段,进一步证实了neo^R基因在正常人造血干、祖细胞的有效转移和表达。