番茄环斑病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法

根据番茄环斑病毒(ToRSV)外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计了2对引物(引物对I和II),利用RT-PCR分别扩增出预期大小的800bp和580bp的条带,其中引物对II扩增效率较高、特异性较好。以引物对I和II进行2轮PCR扩增,建立了巢式PCR检测方法,其灵敏度比普通RT-PCR提高100～200倍。序列测定和分析表明所测定的序列为ToRSVCP基因的部分序列,在系统关系树上与ToRSV的其他分离物形成一簇,亲缘关系很近。

IL-1β对神经元样PC12细胞IL-1RⅠ蛋白表达的影响

目的:探讨IL-1β对神经元样PC12细胞IL-1RⅠ蛋白表达的影响。方法:将PC12细胞传代后以一定的密度种植于培养皿后,NGF诱导其分化成神经元样细胞后,随机分为空白对照组(A组)I、L-1β1ng/mL刺激组(B组)I、L-1β5ng/mL刺激组(C组)、IL-1β10ng/mL刺激组(D组)。24h后分别以MTT法测定各组细胞存活率,Western Blotting方法检测神经元样PC12细胞内IL-1RⅠ蛋白表达。结果:MTT法显示,与A组相比,不同剂量组的IL-1β均可导致神经元样PC12细胞存活率的下降(P<0.01);WesternBlotting方法显示,与A组相比,不同剂量组的IL-1β刺激均可引起神经元样PC12的IL-1RⅠ蛋白表达上调(P<0.05)。结论:IL-1β可引起神经元样PC12细胞的IL-1RⅠ蛋白高表达,这可能与其所致神经元样PC12细胞细胞存活率的下降相关。

半巢式RT-Realtime PCR检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒(Ar MV)外壳蛋白(CP)基因的保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条Taq MAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测Ar MV的新方法。该方法有机地结合了巢式PCR和Taq MAN探针检测技术。第二步半巢式-RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。结果表明:该方法检测灵敏度可达0.06 fg/μL植物总RNA。

同种异型抗原激活并套式PCR法克隆人颗粒溶素Mr 15000与Mr 9000活性片段

目的:采用套式PCR克隆经同种异型抗原激活后的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的颗粒溶素(Granulysin, GLS)Mr 15000与Mr 9000活性片段的编码序列并进行序列测定与分析,为进一步表达纯化该活性片段和研究GLS的免疫杀伤机制奠定基础。办法:抽提经过培养并激活的健康人CTL淋巴细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的Mr 15000 与Mr 9000活性片段的编码序列,插入pET32a(+)载体,转化大肠杆菌TOP10,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行测序分析。结果:成功扩增出了包含GLSMr 15000与Mr9000活性片段完整编码序列的cDNA,与预期大小相同,PCR、酶切及测序鉴定证明得到了读码框正确的pET32a-Mr 15000与pET32a-Mr 9000重组子。序列分析表明GLS基因编码产物在第119 位存在氨基酸多态性。结论:人天然颗粒溶素Mr 15000与Mr 9000活性片段编码序列能够通过以上方法获得和克隆并用于后续研究。

三七皂苷R1对缺氧诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨三七皂苷R1通过调控核因子-κB(NF-κB)信号对缺氧诱导PC12细胞损伤的作用。方法将正常培养的细胞作为对照组;将细胞置于含有5%CO2、94%N2和1%O2的培养箱中培养6 h作为模型组;低、中、高剂量实验组分别在模型组处理方法的基础上予以15,30,60μmol·L^-1的三七皂苷R1培养;中剂量+PMA实验组即在中剂量实验组处理方法的基础上予以2μmol·L^-1的NF-κB信号激活剂PMA的细胞培养液。用流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫吸附试剂盒测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果对照组、模型组、低、中、高剂量实验组、中剂量+PMA实验组细胞凋亡率分别为(1.58±0.26)%,(16.35±1.75)%,(13.20±1.04)%,(9.34±1.13)%,(7.07±0.98)%,(15.53±1.26)%;MDA水平分别为(2.04±0.11),(5.98±0.69),(4.61±0.32),(3.90±0.27),(3.08±0.31),(5.41±0.54)nmol·L^-1;SOD水平分别为(51.24±3.65),(20.87±2.13),(29.71±3.09),(42.84±2.16),(50.77±3.82),(14.17±2.01)U·mL^-1;LDH水平分别为(26.84±2.17),(135.90±10.59),(102.34±8.86),(72.01±6.38),(50.12±3.92),(113.85±9.96)U·L^-1;模型组与对照组比较,低、中、高剂量实验组分别与模型组比较,Exp-M+PMA组与三七皂苷R1中剂量实验组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果三七皂苷R1通过下调NF-κB信号减轻缺氧诱导PC12细胞损伤。

睡菜醋酸乙酯部位化学成分及其神经保护作用研究

目的研究神农架产睡菜Menyanthes trifoliate全草醋酸乙酯部位的化学成分及其神经保护作用。方法采用薄层色谱,正相硅胶、AB-8大孔树脂、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶及制备型HPLC等柱色谱方法分离纯化,利用NMR、MS等波谱学方法鉴定化合物结构。采用体外建立皮质酮诱导PC12细胞损伤模型,就单体化合物对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用进行初步确认。结果从睡菜醋酸乙酯部位中得到了21个化合物,分别鉴定为4-O-咖啡酰奎尼酸甲酯(1)、绿原酸甲酯(2)、绿原酸(3)、异秦皮素(4)、异嗪皮啶(5)、7R,7'R,8S,8'S-(+)-新-橄榄脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、肿柄雪莲苷(7)、丁香脂素(8)、苏式-(7R,8R)-愈创木基丙三醇-8-香草醛醚(9)、(7S,8R)-二氢去氢二松柏醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、(—)-落叶松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(12)、槲皮素-3-O-芸香糖苷(13)、去氢吐叶醇(14)、布卢门醇A(15)、黑麦草内酯(16)、(E)-6-羟基-2,6-二甲基辛-2,7-二烯酸甲酯(17)、3-甲氧基酚-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(18)、2-羟基苯并咪唑(19)、丁香醛(20)、1-苯基-1,2-乙二醇(21)。皮质酮诱导PC12细胞损伤的神经保护作用研究显示,化合物1~3、7、9对皮质酮诱导PC12细胞损伤具有显著的保护作用,化合物4、5、10、11、15~17表现出中等的保护作用。结论化合物1~9、11~12、14~21为首次从该植物中分离得到;部分化合物对皮质酮诱导PC12细胞损伤具有保护作用。