高压氧促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞增殖的时间窗研究

目的:探讨高压氧(HBO)治疗是否可以促进缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠内源性神经干细胞(NSC)的增殖及HBO治疗HIBD的时间窗。方法:采用Rice法制成HIBD模型,分别于HIBD后第3、6、12、24和72h开始给予HBO治疗,1次/d,连续7 d。HIBD后10 d,BrdU/Nestin免疫荧光双标法检测不同时间窗HBO治疗对内源性NSC的影响,Western blot法检测Nestin蛋白的表达;HIBD后28 d尼氏染色法检测海马CA1区锥体细胞密度。结果:HIBD后3、6、12和24 h给予HBO治疗,侧脑室室管膜下(SVZ)区BrdU+Nestin+细胞显著增加(P<0.05),损伤侧大脑Nestin蛋白表达显著高于HIBD组(P<0.05);尼氏染色结果显示HIBD后3、6、和12h给予HBO治疗,海马CA1区神经元丢失较HIBD组显著减少(P<0.05)。结论:HBO治疗可以促进HIBD新生大鼠内源性NSC的增殖,治疗时间窗拓宽至HIBD后24 h可促进NSC增殖,HIBD后72 h进行HBO治疗则疗效不显著。

微环境对周围神经损伤端-侧移位缝合术后神经再生的影响

目的:探讨微环境对周围神经损伤端-侧移位缝合术后神经功能的影响。方法:选取SD大鼠120只,随机分为假手术组(组A)、右侧肌皮神经离断后端-侧缝合至尺神经组(组B)、右侧离断神经端-侧缝合后局部植入神经营养因子组(组C)、右侧离断神经端-侧缝合后局部植入激活态雪旺细胞组(组D)以及右侧离断神经端-侧缝合后局部植入神经干细胞组(组E);于手术后第1、2、4、8周时观察各组大鼠患肢肌力恢复情况,采用梳洗试验以及肱二头肌湿重观察和评价各组大鼠的屈肘功能;分别于术后第1、2、4、8周时检测各组大鼠右侧肌皮神经复合动作电位传导速度(NCV)及右侧肱二头肌复合动作电位(CMAP),术后第8周荧光显微镜观察各组大鼠新生神经轴突数。结果:各组大鼠手术切口均一期愈合,无红肿及溃疡发生;梳洗试验显示2周时各组梳洗试验患肢屈肘活动较差,第4和第8周时组C、D、E屈肘活动有好转;术后组C、D、E肱二头肌湿重重于组B,但比组A轻(P<0.05);术后组C、D、E肌皮NCV快于组B,但比组A慢(P<0.05);各实验组肱二头肌CMAP波幅较组A低,组C、D、E较组B高(P<0.05);术后第8周的神经纤维轴突计数证实组C、D、E新生神经纤维轴突数少于组A,但多于组B(P<0.05)。结论:神经端-侧移位是治疗周围神经损伤的有效方法,局部植入神经生长因子、激活态雪旺细胞、神经干细胞均可促进端-侧缝合后神经再生。

抑制线粒体通透性转换孔的开放削弱淀粉样β蛋白介导的炎症对神经干细胞的凋亡作用

目的:探讨抑制线粒体通透性转换孔的开放对神经干细胞的保护作用。方法:实验设有对照组、条件培养液对照组、Aβ1-42作用组和CsA预处理组。液相芯片技术检测炎性因子的表达,流式细胞术检测神经干细胞的凋亡率,Western blot检测神经干细胞活性caspase-3蛋白的表达。结果:Aβ1-42作用小胶质细胞96 h后,IL-6和TNF-α分别为对照组的7.92和1.22倍。在炎性介质的作用下,神经干细胞凋亡率达到41.17%,与对照组比较差异有显著性(P<0.001),而抑制线粒体通透性转换孔开放后,凋亡率明显降低,同时caspase-3的激活也显著性被抑制。结论:抑制线粒体通透性转换孔的开放可显著性降低神经干细胞的凋亡率,极大地削弱了炎症对神经干细胞造成的凋亡效应,提示抑制线粒体通透性转换孔的开放对神经干细胞具有保护作用。

三种补肾中药有效成分对AD小鼠胚胎神经干细胞自我更新及神经元样分化作用研究

目的观察三种补肾中药补骨脂、女贞子、何首乌各自有效成分补骨脂素、齐墩果酸、二苯乙烯苷对Aβ25-35介导的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)自我更新及向神经元方向分化的调控作用。方法取孕14天昆明小鼠体外分离、培养其胚胎神经干细胞,并随机分为对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+补骨脂素组、Aβ25-35+齐墩果酸组、Aβ25-35+二苯乙烯苷组,其中Aβ25-35干预浓度为25μmol/L,中药有效成分的干预浓度均为10-7mol/L,通过NSCs计数法观察NSCs增殖能力;采用Western blot及免疫荧光法观察神经元标志物Tubulin蛋白表达。计算Tubulin+/DAPI比值。结果与对照组比较,Aβ25-35组NSCs球的形态破坏,NSCs计数、Tubulin蛋白表达及Tubulin+/DAPI均降低(P<0.01,P<0.05)。与Aβ25-35组比较,3个给药组NSCs计数、Tubulin蛋白表达及Tubulin+/DAPI均升高(P<0.01,P<0.05)。结论 25μmol/L Aβ25-35可抑制NSCs自我更新及神经元样分化,而补骨脂素、二苯乙烯苷及齐墩果酸能促进NSCs的自我更新,并能促进其向神经元方向分化。

非同源脑脊液诱导非同源间充质干细胞分化为神经干细胞的对比研究

寻找一种符合患者治疗需求的干细胞获取模式,从而进一步推动神经干细胞广泛应用于临床。本实验采用志愿者、患者脑脊液体外诱导异体脐血源间充质干细胞(UMSCs)和患者骨髓源间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞,并采用形态学、流式细胞分析、免疫组化、荧光免疫组化法等方法对诱导后的细胞进行签定;同时,记录各诱导组获得临床可用神经干细胞所需的时间及细胞数计数。结果证实各组均可使间充质干细胞(MSCs)定向分化为神经干细胞,所获得的细胞数亦可满足临床需要,但在所需的天数及具体获得细胞数量上各组间有一定差异,其中以患者BMSCs用自愿者脑脊液诱导组所获得神经干细胞计数最高,且其所需时间最短。

大鼠创伤性颅脑损伤后脑室下区Notchl蛋白表达的时程变化研究

目的观察创伤性颅脑损伤（TBI）后脑室下区（SVZ）Notch1蛋白表达的动态变化，探讨其与Notch信号通路开放及TBI后神经干细胞（NSCs）增殖的相关性。方法96只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（仅切开头皮和颅骨开窗，n=16）、对照组（不做任何处理，n=16）和实验组（采用Feeney’s自由落体模型建立中型TBI模型，n=64），其中实验组大鼠依据取材时间不同分为1、3、7、14 d亚组，每亚组16只。采用免疫荧光化学染色检测各组大鼠SVZ区脑组织Notch1/巢蛋白（nestin）双标染色阳性细胞表达，采用Western blotting检测Notch1蛋白表达。结果免疫荧光化学染色结果显示，实验组SVZ区脑组织Notch1/nestin双标染色阳性细胞数量在TBI后1 d时即升高出现峰值，达对照组的2~3倍，其后逐渐下降，14 d时基本恢复正常，4个亚组间差异有统计学意义（P〈0.05）；实验组1、3、7 d亚组Notch1/nestin双标染色阳性细胞数量分别与对照组、假手术组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。Western blotting结果显示，对照组及假手术组Notch1蛋白表达量无明显差别，实验组TBI后1 d时SVZ区Notch1蛋白表达量相对较多，后逐渐下降，14 d时降至正常水平。结论大鼠TBI后可激活Notch1蛋白表达，使Notch信号通路开放，从而影响NSCs增殖的调控。

百草枯通过DNA甲基化途径对人神经干细胞增殖的影响

目的观察百草枯(PQ)对人神经干细胞增殖的影响,探讨PQ基于DNA甲基化途径调控人神经干细胞增殖的作用机制.方法以永生化的人神经干细胞系(ReNcell CX)为体外模型,通过间接免疫荧光法检测巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,评估神经干细胞的自我更新和分化潜能;以终浓度0、5、25、50、100 μmol/L PQ作用细胞24h,以及50μmol/L PQ分别作用细胞6、12、24、48 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞存活率;应用终浓度0、25、50、100 μmol/L PQ处理细胞24 h,采用Sox2/Brdu、Nestin/Brdu免疫荧光双标记法检测神经干细胞的增殖能力;采用DNA甲基化定量试剂盒检测细胞总甲基化水平;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)的转录和表达变化.结果增殖期的干细胞能够大量表达Nestin蛋白,经诱导分化后,可获得表达相应特异性标志蛋白的神经元(β-tublin Ⅲ)和星形胶质细胞(GFAP);MTT显示,与对照组比较,PQ呈剂量依赖性和时间依赖性抑制ReNcell CX人神经干细胞的活力;免疫荧光双标记染色显示,Brdu和Sox2均呈双阳性表达,各个染毒组的Brdu+/Sox2+双标阳性率随PQ浓度增加逐渐降低(P<0.05);Brdu+/Nestin+双标阳性率也随PQ浓度增加而逐渐降低,其中50、100 μmol/L染毒组的双标阳性率较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);DNA总甲基化水平检测结果显示,与对照组比较,25、50、100 μmol/L PQ染毒组细胞的总甲基化水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组比较,50、100 μmol/L PQ染毒组的Dnmt1、Dnmt3a蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);50、100 μmol/L染毒组的Dnmt3b蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,与对照组比较,25、50、100 μmol/L PQ染毒组的Dnmt1、Dnmt3a基因表达水平降低,50、100 μmol/L PQ染毒组Dnmt3b基因表达水平明显升高(P<0.05).结论 25、50和100 μmol/L PQ可能通过降低DNA甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a)的蛋白表达和转录水平,抑制DNA甲基化反应的发生,进而抑制人神经干细胞的增殖.