环状人网状蛋白4调节miR-582-5p/神经纤毛蛋白1轴对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨环状人网状蛋白4(CircRTN4)调节miR-582-5p/神经纤毛蛋白1(NRP1)轴对结直肠癌(CRC)细胞恶性生物学行为的影响。方法选取2019年1月至2023年1月河南科技大学第一附属医院收治的CRC患者50例,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹法分别检测患者的癌组织、癌旁组织、人正常结肠黏膜上皮细胞和CRC细胞中CircRTN4、miR-582-5p mRNA及NRP1的蛋白表达;将SW480细胞分别转染si-RTN4、miR-582-5p inhibitor及相应对照,qRT-PCR检测转染效率;通过平板克隆实验、Transwell小室和流式细胞仪等研究CircRTN4对CRC细胞的影响;蛋白质免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及NRP1蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测miR-582-5p与RTN4和NRP1的作用;构建肺癌裸鼠模型,分析敲低RTN4对肿瘤质量、体积及移植瘤中miR-582-5p、NRP1、Ki-67蛋白表达的影响。结果在CRC组织和细胞系中,RTN4、NRP1表达升高,miR-582-5p表达降低(P<0.05);敲低RTN4,降低SW480细胞迁移、增殖与侵袭,下调PCNA、Bcl-2、MMP-2、NRP1表达,促进miR-582-5p、Bax表达及细胞凋亡(P<0.05);miR-582-5p作为RTN4靶点,下调miR-582-5p可减弱RTN4敲低对SW480细胞恶性行为的抑制作用(P<0.05);体内实验显示,抑制RTN4可降低移植瘤质量和体积,降低Ki-67、NRP1表达水平,升高miR-582-5p表达(P<0.05)。结论在CRC组织和细胞系中,CircRTN4高表达,敲低CircRTN4可能通过调节miR-582-5p/NRP1轴抑制CRC细胞的恶性行为。

基于蛋白芯片技术研究参苈加颗粒对慢性心衰大鼠心肌Neuropilin-2表达的影响

目的:应用蛋白芯片技术筛选并探讨参苈加颗粒对心力衰竭大鼠心肌Neuropilin-2表达的影响。方法:将70只清洁级雄性Wi st ar大鼠随机抽取空白组15只,其余用阿霉素造模,将造模成功大鼠随机分为模型组和治疗组,分别给予参苈加颗粒和生理盐水灌胃每日1次,28天后取大鼠左心室组织,用于HE染色和蛋白芯片分析。结果:HE染色显示空白组大鼠心肌正常;模型组大鼠心肌纤维增粗、紊乱,间质增生,少量炎症细胞浸润;治疗组大鼠心肌排列较整齐,间质无明显增生,未见炎症细胞浸润。蛋白芯片可见Neuropilin-2存在差异性表达,与空白组相比,Neuropilin-2在模型组的表达下调;与模型组比较,Neuropilin-2在参苈加治疗组的表达上调;其余2组比较无表达差异。结论:参苈加颗粒可通过调节心肌Neuropilin-2的表达改善心肌纤维化和心肌细胞凋亡,对慢性心衰大鼠心脏起保护作用。

痛风性关节炎的生物标志物

目的筛选大鼠痛风性关节炎(GA)生物标志物。方法采用改良的微晶尿酸钠和次黄嘌呤法制备大鼠急性GA模型,检测血尿酸、尿尿酸、24 h总尿量及滑膜组织病理形态学改变,采用RayBioBiotin Label-based Rat Antibody ArrayⅠ筛选差异表达蛋白。结果急性GA模型建立成功,发现GA中14个差异表达蛋白,其中9个细胞因子首见于GA,差异最明显2个蛋白为TRAIL与Neuropilin-2。结论 TRAIL与Neuropilin-2为GA生物标志物,为临床诊断与防治提供新靶点。

肝细胞生长因子及其受体与神经纤毛蛋白1在骨肉瘤中的表达及意义

目的检测骨肉瘤组织中肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞生长因子受体(C-met)和神经纤毛蛋白1(NRP1)的表达特征,探讨三者的关系及临床意义。方法选择70例骨肉瘤术后留取的蜡块及临床资料作为观察组,选择50例成熟的骨组织脱钙后的蜡块及临床资料作为对照组,应免疫组织化学技术检测2组中HGF、C-met和NRP1蛋白的表达,探讨HGF、C-met和NRP1在肿瘤患者不同临床病理特征的表达差别及其相关性。结果观察组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达的阳性率明显高于对照组,观察组中HGF、C-met和NRP1蛋白表达的阳性率与肿瘤的转移、脉管浸润、临床分期及Ki67的表达密切相关。观察组中HGF、C-met和NRP1之间的表达具有正相关性。结论骨肉瘤组织中HGF、C-met和NRP1高表达,三者对病变的进展具有重要作用,术后联合检测HGF、C-met和NRP1的表达可能对判断预后有一定价值。

Mst1和WASp共同调控调节性T细胞外周稳态及抑制功能

目的以Mst1 KO、WASp KO、Mst1-WASp DKO和野生型模型小鼠为研究对象,探究Mst1和WASp共同作用对调节性T细胞(Treg)发育和功能影响及作用机制。方法使用流式细胞仪检测胸腺和脾脏中T细胞各亚群特别是Treg细胞的比例、数量及其相关分子的表达,并通过构建DKO骨髓嵌合小鼠验证表型变化是否为自发性。结果与野生型小鼠相比,DKO小鼠胸腺的T细胞各亚群比例无明显变化,而脾脏中T细胞各亚群细胞数均降低,除活化T细胞和Treg的比例升高外,其他各T细胞亚群比例均降低。DKO小鼠脾脏Treg中的NRP-1表达减少,CTLA-4的表达增加。骨髓嵌合动物模型中Treg的检测结果与上述一致。结论 Mst1与WASp以细胞固有方式共同影响Treg细胞外周稳态和功能,其机制可能涉及NRP-1和CTLA-4。

神经纤毛蛋白-1的原核表达及兔抗小鼠神经纤毛蛋白-1抗体免疫学活性的研究

目的:在原核系统中分段表达神经纤毛蛋白-1(Nrp1);将纯化的蛋白免疫家兔后获得特异的抗体,并将其应用于检测组织和细胞中Nrp1分子的表达。方法:提取BALB/c胎鼠脑组织总RNA,通过RT-PCR分段扩增获得Nrp1基因片段,将PCR产物插入表达载体pET28a(+),获得含5个Nrp1基因片段的重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导蛋白表达并纯化;将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得针对目的蛋白的特异性多克隆抗体;利用Nrp1特异性多抗检测胎鼠脑组织和HeLa细胞中Nrp1的表达。结果:在原核系统中分段表达了Nrp1蛋白,通过Ni-NTA纯化了Nrp1蛋白片段;纯化的Nrp1蛋白免疫新西兰大白兔获得了具有免疫活性的多抗;兔抗小鼠Nrp1特异性多抗可用于检测组织、真核细胞中Nrp1的表达。结论:应用原核系统成功地表达了Nrp1蛋白,兔抗小鼠Nrp1特异性多抗可用于免疫学检测Nrp1分子的表达。

神经菌毛素1 b结构域的克隆及表达

目的:制备重组人神经菌毛素1(NRP1)b结构域蛋白。方法:采用PCR技术,从p GEM-NRP1克隆载体中扩增人NRP1 b结构域(HuNRP1~b)cDNA,并将其克隆入pCold TF,构建重组原核表达质粒pCold-HuNRP1~b并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,制备重组大肠杆菌BL21(DE3)(pCold-HuNRP1~b),低温条件下用IPTG诱导重组菌的表达,制备重组蛋白TF-HuNRP1~b。结果:酶切、测序结果表明pCold-HuNRP1~b构建成功,经SDS-PAGE分析,重组质粒转化表达菌后重组蛋白TF-HuNRP1b获得表达,融合蛋白相对分子质量约90×10~3。结论:获得原核表达的重组HuNRP1~b蛋白,为该蛋白的规模化生产及其单克隆抗体的制备提供了有效的生物材料。

鼠神经菌毛素1蛋白的真核表达及其鉴定

目的制备重组鼠神经菌毛素1(mNRP1)蛋白。方法将表达载体pCMV3-mNRP1-flag(pCMV-mNRP1)转化大肠杆菌DH5α感受态,扩增重组质粒;随后将pCMV-mNRP1转染哺乳动物细胞株HEK293,间接免疫荧光法(IFA)及western blot法鉴定重组蛋白mNRP1(flag-mNRP1)的表达。结果 IFA及western blot结果显示重组质粒转染HEK293后,flag-mNRP1获得有效表达,融合蛋白相对分子质量约为120 000。结论重组蛋白mNRP1在真核表达系统中获得成功表达,该蛋白的获得为进一步研究NRP1的生物学功能提供有效的生物材料。

非小细胞肺癌患者六种血清指标的变化及其检测价值

目的探讨血清半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、高迁移率族蛋白A2(HMGA2)、神经纤毛蛋白-1(NRP-1)、癌胚抗原(CEA)、鳞癌相关抗原(SCC-Ag)及细胞角蛋白-19片段(CYFRA 21-1)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的水平变化及临床意义。方法回顾性选取2019年3月至2022年3月滁州市第一人民医院诊治或检查的79例NSCLC患者(NSCLC组)、39例良性肺部疾病患者(良性对照组)及50例健康体检者(健康对照组),比较三组血清Galectin-3、HMGA2、NRP-1、CEA、SCC-Ag及CYFRA 21-1水平的差异,分析Galectin-3、HMGA2、NRP-1和常规肿瘤标志物与NSCLC临床病理特征关系及对淋巴结转移、临床分期预测价值。结果NSCLC组血清Galectin-3、HMGA2、NRP-1、CEA、SCC-Ag、CYFRA 21-1表达高于良性对照组、健康对照组(P<0.05)。血清Galectin-3、HMGA2、NRP-1、CYFRA 21-1、CEA水平与NSCLC患者的肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、临床分期,呈全部或部分相关(P<0.05),SCC-Ag与病理类型有关(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,Galectin-3、HMGA2、NRP-1、CEA、CYFRA 21-1是影响NSCLC淋巴结转移、临床分期Ⅲ~Ⅳ期的独立危险因素(P<0.05)。血清Galectin-3、HMGA2、NRP-1、CEA、CYFRA 21-1预测NSCLC淋巴结转移的AUC分别为0.950、0.878、0.745、0.771和0.706,预测NSCLC临床分期Ⅲ~Ⅳ期的AUC分别为0.934、0.865、0.755、0.695和0.698。结论NSCLC患者血清Galectin-3、HMGA2、NRP-1及常规肿瘤标志物CEA、SCC-Ag、CYFRA 21-1水平均明显升高,且Galectin-3、HMGA2、NRP-1均与淋巴结转移、临床分期有关,可作为NSCLC淋巴结转移及临床分期的新型预测指标。

神经纤毛以及类似透拉蛋白2对胆囊癌细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响及相关机制研究

目的探讨神经纤毛以及类似透拉蛋白2(NETO2)对胆囊癌细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响及分子机制。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和免疫印迹法分别检测胆囊癌细胞系GBC-SD、ZJU-0430、NOZ中NETO2的mRNA及蛋白表达水平,利用质粒转染法构建NETO2过表达及敲减的稳转细胞株。通过细胞计数法(CCK-8)、克隆形成实验、细胞迁移实验、流式细胞术和免疫印迹法检测NETO2对胆囊癌细胞增殖、克隆形成能力、迁移、周期进程、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的变化。结果成功构建NETO2基因过表达的胆囊癌GBC-SD及ZJU-0430细胞,NETO2基因敲减的NOZ细胞。在ZJU-0430、GBC-SD细胞过表达NETO2后,胆囊癌细胞的增殖及迁移能力提高;可促进细胞从G0/G1期向S期进展,并抑制细胞凋亡;细胞克隆数分别由(78.5±9.2)、(217.0±6.4)增加为(213.5±10.3)、(296.3±9.3)(t=10.98、6.51,P=0.008、0.023);迁移细胞数分别由(100倍视野)(198.6±8.4)个、(233.3±11.0)个增加为(382.7±12.4)个、(379.0±7.3)个(t=16.98、16.85,均P<0.001);细胞总凋亡率由(29.7±0.9)%、(35.6±1.1)%降低为(19.2±0.5)%、(29.1±0.4)%(t=9.74、9.05,均P<0.001);EMT相关蛋白如N-钙粘蛋白、波形蛋白、锌指转录因子Snail、Slug表达上调,而E-钙粘蛋白表达下调;PI3K/Akt通路磷酸化蛋白p-PI3K及p-Akt表达上调,上述变化差异均具有统计学意义(均P<0.05)。而敲减NETO2表达则导致相反的变化。结论NETO2通过调控PI3K/Akt信号通路影响EMT进程,从而促进胆囊癌细胞的增殖和迁移,促进癌细胞周期进程并抑制癌细胞凋亡。

Netol—siRNA干预对疼痛模型大鼠条件回避行为和前扣带回NMDA受体亚基的影响

目的探讨NetO1-siRNA干预对神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）模型大鼠痛相关负性情绪和前扣带回（anterior cingulate cortex，ACC）的Neto1（Neuropilin and tolloid—like1）以及N-甲基-D-天冬氨酸（N—methyl-D—aspartate，NMDA）受体亚基NR2A和NR2B表达的影响。方法健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为假手术组（sham operated group，SO组）、坐骨神经慢性压迫疼痛模型组（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI组）。术后第24天，s0组和CCI组大鼠ACC部位经脑立体定位注射LV—Neto1—RNAi（30160—1），制备成siRNA SO组和siRNA CCI组。每组10只大鼠。采用坐骨神经慢性压迫损伤制备大鼠CCI模型。各组大鼠分别于第7天、14天、21天和28天测量机械缩足阈（mechanical with drawal threshold，MWT）和热缩足潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。RT—PCR和Western Blotting方法检测ACC部位的Neto1、NR2A和NR2B的mRNA和蛋白表达水平。结果CCI组的TWL和MWT比SO组均降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。CCI组回避分数[（410．54±44．79）s]比SO组[（240．23±27．02）s]升高，差异有统计学意义（P〈0．05），但与siRNA CCI组[（395．16±36.25）s]比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。RT-PCR结果显示，CCI组Neto1、NR2A和NR2B表达水平比SO组均升高（P〈0．05），经Neto1—siRNA干预后，Neto1和NR2A表达水平降低（P〈0．05），但NR2B无显著变化。Western Blotting结果显示，CCI组Neto1、NR2A和NR2B表达水平比SO组均升高（P〈0．05），经Neto1—siRNA干预后，Neto1和NR2A表达水平降低（P〈0．05），但NR2B无显著变化。结论ACC部位的Neto1表达降低可以下调NMDA受体亚基NR2A的表达，但不影响NP所诱导的痛相关负性情绪。