基于ISSR标记的扁玉螺(Neverita didyma)自然居群遗传结构

利用ISSR分子标记技术,对采自大连(DL)、烟台(YT)及青岛(QD)近海的扁玉螺3个自然居群的遗传结构和遗传多样性进行了分析。用13个引物对90只个体进行了PCR扩增,共检测到161个位点,3个居群的多态位点比例为74.53%～85.09%,各居群遗传多样性水平的高低依次为YT>QD>DL。扁玉螺在物种水平上的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数分别为0.3395和0.5113,在居群水平上分别为0.2811和0.4189,显示出扁玉螺有着较高的遗传多样性。AMOVA分子变异分析表明,扁玉螺的遗传变异有27.16%发生在居群间,72.84%发生在居群内,居群内的遗传变异大于居群间的遗传变异。扁玉螺3个居群间的遗传分化系数(Gst)为0.1720,基因流(Nm)为2.4063,Nei’s遗传距离平均值为0.1228,表明扁玉螺居群间虽然存在着一定程度的遗传分化,但仍属于种内正常分化的范畴。上述结果为保护和利用扁玉螺资源提供了科学依据。

扁玉螺(Neverita didyma)表型性状对体重和软体部重的影响效应分析

采用相关分析和通径分析的方法,研究了扁玉螺的表型形态性状对体重和软体部重的影响。随机抽取2龄扁玉螺100只,分别测定其壳宽、壳高、壳顶至胼胝高、体高、厣长、厣宽、体重、软体部重共8项性状参数,并分别计算了各性状间的相关系数,以及以表型性状为自变量对体重和软体部重作因变量的通径系数和决定系数。结果表明,各表型性状与体重、软体部重之间的相关系数均达到极显著水平(P<0.01)。壳宽对体重和软体部重的直接效应均为最大,对二者的决定程度也最高,是影响体重和软体部重的最主要因素;而厣宽、壳顶至胼胝高和体高的直接作用较小,它们主要通过壳宽的间接作用影响体重和软体部重。因此,对壳宽的直接选择可有效地增加体重和软体部重,对壳顶至胼胝高、厣宽和体高的选择也有助于增加扁玉螺的重量。

扁玉螺(Neverita didyma R  ding)消化系统的形态学研究

扁玉螺消化系统由消化道——口、食道、胃、肠和直肠以及消化腺——食道腺和肝脏组成，无唾液腺．消化道粘膜上皮有纤毛柱状细胞、杯状细胞和颗粒细胞三种细胞．食道腺仅有一种腺细胞．肝脏由消化细胞、隐窝细胞和贮藏细胞组成。

扁玉螺(Neverita Didyma Roding)消化系统的组织化学研究

以多种组织化学方法研究了扁玉螺的消化系统．除直肠外，其余消化道的纤毛柱状细胞呈现蛋白酶、非特异性酯酶和脂酶活性，其游离端质膜呈现碱性磷酸酶活性．杯状细胞分泌弱硫酸化酸性粘多糖．食道腺腺细胞以及肝脏消化细胞显示蛋白酶、非特异性酯酶和脂酶活性，后者还显示酸性磷酸酶活性．隐窝细胞含有铁．

黄、渤海扁玉螺(Neverita didyma)表型变异分析

采用多变量形态分析方法,对黄、渤海海域的丹东、烟台、青岛、赣榆、昌黎和莱州6个地理居群的扁玉螺的表型形态变异进行了研究。主成分分析构建了3个主成分,第一、第二和第三主成分的贡献率分别为41.68%、28.45%和27.67%,累计贡献率达97.80%。聚类分析结果显示,烟台居群与青岛居群之间的形态最为接近,二者首先聚为一支;丹东居群与赣榆居群聚为另一分支;昌黎居群、莱州居群与其它居群的趋异程度较大。方差分析和Duncan's多重比较表明,扁玉螺各居群之间的若干形态差异显著(P<0.05)。利用逐步判别法进行判别分析,建立了6个居群的判别函数,判别准确率P1为52.9%—86.5%,P2为52.4%—89.1%,综合判别准确率为74.4%。上述结果显示,6个居群的扁玉螺在表型形态上已出现了一定程度的变异,壳高、壳顶至胼胝高是反映其形态变异的主要性状,但各居群间的变异尚未分化到亚种水平。

扁玉螺植物消化特性的初步研究

对扁玉螺各消化器官消化酶活力测定表明，扁玉螺有一定的消化植物的能力，其中淀粉水解能力相对较高和较稳定，纤维素水解能力低，没有褐藻酸水解能力，海藻多糖水解能力不稳定，蛋白质和脂肪水解能力处于相对较低的水平．比较各消化器官重量和蛋白含量，表现唾液腺和肝脏的作用接近，胃、小肠和直肠作用接近。

扁玉螺早期发育的实验观察

在实验室条件下人工孵化扁玉螺（Neverita didyma）的卵块,观察了其胚胎发育和幼虫发育过程。扁玉螺的早期发育属间接发生型,其胚胎发育包括卵裂期、囊胚期、原肠胚、膜内担轮幼虫、膜内面盘幼虫;幼虫发育包括面盘幼虫、后期面盘幼虫和匍匐幼虫;匍匐幼虫经变态后发育为稚螺。在水温25～26℃条件下,受精卵发育至膜内面盘幼虫约需38h,5～6d后面盘幼虫冲破卵膜而孵化。扁玉螺面盘幼虫的显著特点是具有1对眼点和1对平衡囊,面盘呈双叶状;后期面盘幼虫的面盘为4叶,呈蝴蝶状,足发达,幼虫既能浮游,又能爬行。后期面盘幼虫进一步生长发育,逐渐转入匍匐生活。

3种经济螺体内4种重金属元素含量及评价

以样品湿法消解消化法和火焰原子吸收光谱仪测定大口乳玉螺扁玉螺、亮螺的肌肉、肝脏、性腺3种器官组织中的As、Pb、Cd、Zn等4种金属元素的含量.分析不同种类的螺各器官重金属含量和重金属污染指数,评价各种螺的重金属污染反映其受污染程度和食用价值.结果表明:重金属在不同种类水产品不同组织器官中的分布不同;3种螺都受到了不同程度的重金属污染;3种螺的As都超过了"海洋生物污染评价标准"和"人体消费卫生标准",其他的3种重金属含量也都不同程度地超过"两个标准".

扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系。该反应体系包括:2.0mmol·L-1的Mg2+,0.25 mmol·L-1的dNTP,0.8 U的Taq DNA聚合酶,0.2μmol·L-1的ISSR引物和40 ng模板DNA。利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出13条扩增效果较好的引物,为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性奠定了基础。

扁玉螺的生殖腺组织学和生殖周期

采用组织切片和HE染色法,对烟台沿海扁玉螺的生殖腺发育过程进行了观察。根据性腺发育的组织学特征,将扁玉螺生殖腺发育过程分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期;扁玉螺在烟台沿海每年一个生殖周期,繁殖季节为5月上旬至8月中旬,繁殖盛期为6月上旬至7月下旬。上述研究结果探明了扁玉螺的生殖腺发育规律,丰富了扁玉螺的繁殖生物学资料,对开发利用扁玉螺有着积极的意义。

温度和规格对扁玉螺耗氧率和排氨率的影响

在实验生态条件下 ,研究了温度对不同个体大小扁玉螺耗氧率和排氨率的影响。实验结果表明 ,在实验温度 ( 1 0～ 35℃ )条件下 ,扁玉螺的个体耗氧率 (R′O) [mg/个·h]和个体排氨率 (R′N) [mg/个·h]与软体部干重 (W)呈正相关 ,而耗氧率 (RO) [mg/g·h]、排氨率 (RN) [mg/g·h]与软体部干重呈负相关 ,二者之间均可用幂函数表示 ;扁玉螺的耗氧率和排氨率均随温度的升高而增加 ,但超过 30℃后 ,耗氧率则下降 ,耗氧率 (RO)、排氨率 (RN)与温度之间呈明显的指数函数关系。不同规格扁玉螺的耗氧率和排氨率的比值 (原子数O :N)在 2 0℃时最大。方差分析表明 ,温度、软体部干重对扁玉螺的耗氧率和排氨率有极显著的影响 (P <P0 .0 1 )。

重金属离子对扁玉螺细胞色素氧化酶的影响研究

测定了扁玉螺（ＮｅｖｅｒｉｔａｄｉｙｍａＲｏｄｉｎｇ）肝脏中细胞色素氧化酶活力，其最适温度为４４°Ｃ，最适ｐＨ值７．０．研究了Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋，Ｚｎ２＋三种重金属离子在离体（ｉｎｖｉｔｒｏ）条件下对该酶的影响，结果显示：低浓度的Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋对其具有激活作用，高浓度的Ｆｅ３＋，Ｃｕ２＋及低浓度的Ｚｎ２＋对其具有显著的抑制作用．

扁玉螺中枢神经系统解剖及显微结构观察

对扁玉螺(Neverita didyma)中枢神经系统的大体解剖和显微结构进行了初步研究。结果表明,扁玉螺中枢神经系统包括一对口球神经节、一对脑神经节、一对侧神经节、一对足神经节及一个脏神经节。各神经节均由神经节被膜、胞体区及中央纤维网三部分组成。左右脑神经节之间和左右足神经节之间的联合以及脑-侧、脑-足和侧-足神经节之间的连索均较短。足神经节有明显的分区现象。

扁玉螺转录组SSR信息分析

采用生物信息学方法分析扁玉螺转录组文库EST序列(SSR)位点,并且设计简单重复序列(SSR)引物,以期为扁玉螺分子标记辅助育种提供有力的工具。对扁玉螺进行转录组测序采用Illumina Hiseq^(TM)高通量测序平台,再利用Micro SAtellite(MISA)工具,分析扁玉螺转录组中SSR的重复基元及其分布频率。利用Primer 3软件设计引物,并且通过SSRFinder筛选出SSR引物。从233 853条Unigenes中找到202 337个符合条件的SSRs,发生频率为45.34%,SSR位点的出现频率为86.53%。SSR位点中单核苷酸重复是主要类型,占总SSRs的63.44%,其次为双核苷酸和三核苷酸,分别为24.12%和6.73%。SSR所包含的重复基元中,单核苷酸重复基元A/T最多,占总SSR的54.15%;其次为双核苷酸AC/GT多,为15.9%。扁玉螺转录组中SSR位点出现频率高,而且类型丰富;大量的SSR分子标记技术有助于扁玉螺分子育种与遗传多样性分析提供更多的依据。

扁玉螺血细胞体外凝结影响因子的研究

以扁玉螺(Neverita didyma)血淋巴为试验材料,比较研究不同保存温度、时间及血细胞浓度与其血细胞凝结的关系。结果表明:血淋巴中血细胞的凝结程度随样品放置时间延长而呈现先升高后降低的变化规律,20℃条件下以放置20 min组的细胞凝结度最高。血细胞的凝结程度随血细胞浓度的升高而明显上升,细胞浓度为0.5×106个/ml的血淋巴样品20℃放置20 min后,91%的血细胞单独存在;而细胞浓度为7.6×106个/ml时,单个存在的血细胞仅有35%。血细胞的凝结程度随温度的降低而下降。

扁玉螺多糖的提取、分离和结构分析

目的从扁玉螺(Neverita didyma)中提取和分离纯化多糖,并对其基本理化性质和结构组成进行分析。方法依次采用水提和碱提方法从扁玉螺中提取粗多糖,采用DEAE Sepharose FF阴离子交换和Sephacryl S-300凝胶柱层析对粗多糖进行分离纯化,并对其总糖、蛋白、氨基糖、糖醛酸和硫酸根含量,相对分子质量和单糖组成进行分析。对多糖纯化组分采用甲基化、气质联用(GC-MS)、红外光谱(IR)、电喷雾质谱(ESI-MS)和核磁共振波谱(NMR)对其化学结构进行分析。结果扁玉螺水提粗多糖(BYL-S)中不含有糖醛酸和硫酸基,其单糖组成只含Glc,进一步分离得到了4种水溶性多糖组分。碱提粗多糖(BYL-J)单糖组成相对复杂,除含有Glc外,还含有Man、GlcN、GalN、Gal和Fuc,其摩尔比为Glc∶Man∶GlcN∶GalN∶Gal∶Fuc=78.9∶1.7∶3.4∶2.2∶5.2∶5.6,进一步分离得到了3种多糖组分。对水提多糖纯化组分BYL-S2的结构分析表明其是以α-(1→4)为主链,含有少量β-(1→3,4)和β-(1→3)分支的D-吡喃型葡聚糖。结论从扁玉螺中提取分离得到了7种多糖组分,并确定了一种水溶性葡聚糖的结构,为扁玉螺多糖结构和活性的深入研究提供了基础。

扁玉螺鳃的形态学研究

用光镜和扫描电镜观察了扁玉螺（Neveritadidyma）鳃的组织学和表面结构。鳃叶上皮由5个区带的细胞组成，即前纤毛柱状细胞、立方细胞、侧纤毛柱状细胞、后纤毛柱状细胞及呼吸上皮。侧纤毛是产生呼吸水流的动力来源；呼吸上皮细胞表面凹凸不平，其组织学和表面结构有助于进行气体交换。

饵料对扁玉螺浮游幼虫存活与生长的影响

采用投喂小球藻、角毛藻、鱼腥藻、螺旋藻以及小球藻和角毛藻5组饵料分别投喂扁玉螺浮游幼虫,每天测定壳宽和存活率,结果表明,8天后,投有角毛藻的2组存活率较高,生长较快。笔者认为,角毛藻是扁玉螺浮游幼虫的适合饵料。