乳腺癌原代细胞系为药物筛选和基础研究提供癌症新模型

背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果没有在临床试验中获得对应的预期,导致绝大部分潜在药物临床试验失败。癌症细胞系失去价值归因于肿瘤细胞经过长期培养后,其增殖和转移等主要生物学行为和与之有关的关键蛋白质系统发生了根本改变,已不能代表患者的真实癌症特征。现阶段需要创立一种来源于患者新鲜癌症组织和具有清晰临床背景的新癌症模型。本研究旨在为药物研发和基础研究建立经济的患者来源的可以无限传代的乳腺癌原代细胞系。方法:乳腺癌组织在贵州医科大学附属医院乳腺外科收集。肿瘤组织样本收集得到贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(伦理编号:2022伦理第313号),收集和使用肿瘤组织均遵守赫尔辛基宣言,患者的乳腺癌组织消化分离后在BCMI培养基中培养,待乳腺癌细胞增殖到一定数量时更换成DMEM培养基。乳腺癌细胞经短串联重复序列(short tandem repeat,STR)检测确定细胞特异性遗传学标志和来源。克隆形成实验和动物实验分析乳腺癌原代细胞系形成肿瘤的能力。结果:成功建立了6种乳腺癌原代细胞系。他们具有清晰的临床病理学特征,包括病理学标志性分子检测、临床诊断、治疗方案和结果以及确定的预后结果。STR检测确定了6种乳腺癌原代细胞系特异性遗传标志和确定了该细胞系的来源。克隆形成实验和动物移植实验说明乳腺癌原代细胞系增殖能力显著大于传统乳腺癌细胞系,二者在形成肿瘤能力方面存在明显的差异。结论:构建的6种乳腺癌原代细胞系为乳腺癌药物研发和基础研究提供了新的癌症模型。

不同品系黑腹果蝇细胞系的建立(Ⅱ)——黑条体突变型(BSR)细胞系的建立和生物学特征

为了广泛选择外源真核基因高频扩增及高效表达的载体和受体系统，利用改良的Ｍ３（ＢＦ）培养基从黑腹果蝇（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＭｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）黑条体（Ｂｌａｃｋｓｔｒｅａｋｂｏｄｙ·ＢＳＲ）的胚胎中建立了一株细胞系命名为ＢＳＲ９８０４．原代培养４０ｄ形成单层细胞，以１∶２分种率７ｄ传代一次，连续传代４０代次，细胞倍增时间为１８ｈ，细胞系以２倍染色体为主，未发现结构异常的染色体，２％胎牛血清为维持细胞生存的最小需要量，细胞系可在４℃普通冰箱中保存复苏．

甘草提取物诱导胃癌MGC-803细胞凋亡的初步研究

目的 :研究甘草提取物诱导胃癌MGC 80 3细胞发生凋亡。方法 :用荧光双染、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等方法 ,观察甘草提取物处理MGC 80 3细胞后细胞形态和染色质DNA等的变化 ,以双重免疫标记法和免疫组化法检测处理前后 p53基因表达的变化。结果 :激光扫描共聚焦显微镜观察到处于不同凋亡进程中的细胞 ;流式细胞仪检测到显著的凋亡峰 ,且凋亡百分率呈浓度、时间依赖性 ;高浓度甘草提取物处理的MGC 80 3细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的“ladder” ;甘草提取物对p53基因表达没有影响。结论 :甘草通过p53非依赖途径诱导MGC 80 3细胞凋亡 ,可望作为一种新的细胞凋亡诱导剂用于胃癌的治疗。

铝电解槽阴极内衬材料及结构的改进

论述了近年来铝电解槽设计中阴极内衬材料和结构形式的改进,通过对比说明新型阴极内衬材料及结构形式所具有的优点以及应用的必要性。

新型八核铜配合物乳剂对小鼠H_(22)腹水瘤的抑制作用

目的探讨新型八核铜配合物乳剂(Nanoporous Octanuclear Cu(Ⅱ),N-Cu)对接种H22腹水瘤小鼠的治疗作用。方法昆明种小鼠90只,腹腔内接种H22腹水瘤细胞株造模,随机分为6组,即生理盐水组、空白乳剂组、顺铂组(DDP 1.0 mg/kg)、低剂量N-Cu组(0.2 mg/mL)、中剂量N-Cu组(0.4 mg/mL)和高剂量N-Cu组(0.8 mg/mL)。H22腹水瘤模型建立24 h后,尾静脉注射0.2 mL/10 g治疗,1次/d,连续给药7 d,观察小鼠的生活状态。称动物体重、腹围及每组采食量,第7天给药后24 h,每组处死5只小鼠,抽取全部腹水,测量腹水体积。取心、肝、脾、肺、肾,肉眼观察,并做病理切片。剩余小鼠观察生存时间,并计算生命延长率。结果与生理盐水组相比,顺铂、不同剂量的N-Cu可显著抑制小鼠H22腹水的生成;各试验用药组较生理盐水组小鼠寿命延长,其中高剂量N-Cu组延长最明显(P<0.05);病理切片结果观察得知:N-Cu各剂量组能显著改善肝环境。结论 N-Cu能抑制小鼠H22腹水的生成,明显延长生存期。

新生牛肝中低分子抑瘤物影响白血病细胞生长的实验研究

新生牛肝经匀浆、离心和分级超滤后,得到分子量≤1.0kDa的、耐热的成分——新生牛肝抑瘤物(new-bom calfliver suppressor,BLS-1)。对BLS-1的生物学活性进行了检测,结果表明在体外液体和半固体琼脂培养条件下,它对人和小鼠白血病细胞系(如HL-60、L833 和 P388 等)的生长均有明显的抑制作用,并存在着一定的量效关系;与同样条件下BLS-1对人和小鼠正常粒-巨噬系祖细胞的抑制作用相比较,BLS-1对白血病细胞生长的抑制作用具有较强的选择性。进一步观察了BLS-1对5例急性非淋巴细胞白血病病人骨髓的原代白血病细胞集落(leukemic blast progenitor,L-CFU)生成的影响,结果表明,当BLS-1的浓度达到500μg/ml时,L-CFU的生成受到明显抑制。上述研究结果提示,在新生牛肝中可能存在类似于人胎儿肝脏中的一类低分子天然抑瘤物。

评价新型3,5-二取代吡唑啉衍生物抗人肺癌细胞株(A549)的潜能

目的 评估新型3,5-二取代吡唑啉衍生物抗人肺癌细胞株(A549)的潜能。方法 制备新型吡唑啉衍生物,评价这种衍生物在体外对抗人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549的效能。利用MTT法与SRB法筛查全部最终衍生物的抗癌潜力,测定其存在的细胞毒性。结果 本文条件下制备最终化合物用时10d,在表达抗A549中存在细胞毒性潜能,占比约为71.24%,对照药物为阿奇霉素,阿奇霉素所具有的细胞毒性为80.55%,两组相较并无差异(P>0.05)。所制备的新型吡唑啉衍生物的抗癌活性SRB检查结果与MTT法检查所得的细胞毒性结果类似,其成分为具有甲硫基、氟基团、甲氧基官能团的化合物,10d对抗A549的GI50水平为11.41μg/mL,对照药物ADR的TGI水平>100μm,化合物10d为46.76μm。结论 新型吡唑啉衍生物抗NSCLC的A549细胞株的潜力理想,细胞毒性水平较为合理。

生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞表达HBsAg的研究

应用新型聚酯纤维盘片,采用连续灌注培养方式,分别试验了细胞接种量、pH、DO、罐流速度等因素对CHO-C28细胞生长分泌HBsAg的影响,初步建立了5L生物反应器生产重组乙型肝炎疫苗的生产工艺。经3次试验培养,每次培养60d,较适宜的培养条件确定为:pH6.80-7.10,DO 20%-30%,温度36-37℃,灌流速度138ml/h,接种浓度1.9×106cell/ml。收获液的HBsAg平均滴度是1∶256,最高滴度可达1∶512,纯化后的HBsAg产率为0.912mg/L。最后对反应器培养工艺与现行的转瓶培养工艺进行了比较,生物反应器培养具有可控制培养条件、不易污染和可使HBsAg产率提高等优点。

200kA铝电解槽内衬结构优化对生产指标的影响

某厂200 kA电解系列在运行一定时间后,普遍存在阴极破损、侧部炭块掉落、整体稳定性差、电解生产指标较差等问题,因此,在2012年已改进电解槽的基础上采用新型阴极钢棒技术再次对内衬结构进行优化改进。优化后,通过对比分析实际生产数据发现,与2012版改进电解槽相比,2019版改进电解槽的冲击电压较低,槽内衬裂纹的产生和电解槽早期破损现象减少,伸腿适宜,炉膛较为规整,电解槽稳定性更好,槽寿命延长,电流效率提升,直流电耗降低。

4株患者原代细胞源的乳腺癌细胞系建立及初步研究

目的从患者的肿瘤组织建立可以传代的乳腺癌原代细胞系,为基础研究提供新的细胞模型。方法经穿刺取材的患者乳腺癌组织经过Ⅱ型胶原酶消化后培养在BCMI培养基中。当细胞快速增殖时,更换为DMEM培养基。检测STR基因分型确定4种乳腺癌原代细胞的特异遗传标记。集落形成实验和球形成实验分析乳腺癌原代细胞系致瘤性。Real-time PCR和Western blot实验分析乳腺癌原代细胞上皮间充质转换分子。转移实验和侵袭实验分析乳腺癌原代细胞的转移能力。结果培养了4种乳腺癌原代细胞系BC25#,BC51#,BC56#和BC57#。这些乳腺癌细胞系培养基是DMEM培养基,可以传代,具有清楚的临床背景。STR基因分型确定了4种乳腺癌原代细胞系特异的遗传标记。集落形成实验和成球实验发现4种乳腺癌原代细胞系比传统的乳腺癌细胞T-47D有更强的形成肿瘤能力。Real-time PCR和Western blot实验发现,与传统的乳腺癌细胞T-47D相比,4种乳腺癌原代细胞系E-cadherin表达降低,vimentin表达升高。迁移实验和侵袭实验发现原代细胞系BC25#比传统的乳腺癌细胞T-47D有更强的转移能力。结论培养了4种可以传代的乳腺癌原代细胞系BC25#、BC51#、BC56#和BC57#,为乳腺癌基础研究提供了新的肿瘤细胞模型。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID_(50))、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示:临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID_(50)高达10^(-6.25)/mL,鸭胚半数致死量(ELD_(50))为10^(-4.5)/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%~98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%~94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。

人乳腺癌原代细胞系的建立及其对药物的敏感性

目的探讨人乳腺癌(BC)原代细胞系的培养建立并分析其药物敏感性。方法取BC浸润性导管癌患者的BC组织4份,Ⅱ型胶原酶消化并培养于BC第1代培养基(BCMⅠ),细胞快速增殖时更换为杜氏改良Eagle培养基(DMEM),利用倒置显微镜观察细胞形态,明确是否成功培养无限传代的4种BC原代细胞系;采用短串联重复序列(STR)分析上述4种原代细胞系的特异性遗传标记;取对数生长期的4种BC原代细胞系,分为50 nmol/L多柔比星(Doxorubicin)组、50 nmol/L吡柔比星(Pirarubicin)组及对照(Control)组(不加药物),采用CellTiter法检测细胞活力判断对其药物的敏感性;收集上述细胞来源的4例BC浸润性导管癌患者的一般临床资料、病理资料[组织学类型、年龄、肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移(TNM)分期、病理分级、淋巴结转移及月经情况等]及新辅助、术后辅助治疗方案信息,采用苏木精-伊红染色(HE)检测BC组织的形态学特征及BC分型,采用免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)观测BC组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、雄激素受体(AR)、细胞角蛋白5/6(CK5/6)、增值细胞核抗原(Ki-67)、拓扑异构酶Ⅱ(TOP-Ⅱ)分子及HER-2基因的表达。结果成功培养了4种永生化的乳腺癌原代细胞系,分别为BC8#、BC11#、BC19#及BC21#;STR检测4株乳腺癌原代细胞为没有交叉污染的人来源细胞系,这些乳腺癌原代细胞系有明确的临床病理特点、病理标志物检测、临床诊断及治疗方案结果及CellTiter-Glo试剂盒检测结果显示,50 nmol/L Doxorubicin可以不同程度的抑制BC8#、BC11#、BC19#及BC21#细胞生长(P<0.05);50 nmol/L Pirarubicin不同程度地抑制BC11#和BC19#细胞生长,但对BC8#和BC21#细胞生长没有作用(P<0.05)。结论成功培养了4种永生化的乳腺癌原代细胞系,这4种乳腺癌原代细胞系对化疗药物Doxorubicin和Pirarubicin的反应不同。

源于鲨鱼肝的一种新基因的克隆表达及其对肝肿瘤细胞的抑制作用(英文)

目的:从鲨鱼肝脏中克隆表达一种新基因psl12,纯化该基因的表达产物,研究其对肝肿瘤细胞的抑制作用。方法与结果:我们前面已报道发现了鲨肝细胞再生刺激因子(sHRSF),根据sHRSF的N端氨基酸序列设计了引物,并利用RT-PCR方法从鲨鱼再生肝组织的总RNA中扩增到大小约为350bp的cDNA片段,序列分析表明350bp的片段含有一个开放阅读框(ORF),含有333个碱基,编码111个氨基酸残基,其编码的N端氨基酸序列与天然sHRSF的前7个氨基酸一致。该肽被命名为PSL12(来源于鲨肝的分子量约为12kD的肽)。该cDNA被连接到质粒pGEM-T-Easy,获得重组质粒pGEM-T-psl12。根据cDNA序列分析和质粒pET-32a的多克隆位点(BamHⅠ和SalⅠ)的序列,设计并合成了psl12基因的特异性引物,质粒pGEM-T-psl12作为模板,进行了PCR扩增。将此PCR产物插入pET-32a得到表达质粒pET-32a-psl12,并将它转化入E.coli的BL21菌株。经IPTG诱导,带有组氨酸标签的融合蛋白的表达量约为40%。用金属螯合层析纯化融合蛋白后,再用FXa切割融合蛋白,经Resource Q和Mono Q柱层析得到PSL12纯品,它可抑制肝肿瘤细胞株SMMC-7721和HepG2的增殖。结论:从鲨鱼肝脏中获得了一种新基因psl12。该基因的表达产物PSL12能显著抑制体外培养的肝肿瘤细胞的增殖。

新型永生化人肝细胞系HepZJ的安全性研究

目的对新型永生化人肝细胞系Hep ZJ进行安全性研究。方法获取Hep ZJ培养上清液,通过PCR联合琼脂糖凝胶电泳法进行支原体检测,通过显色基质法进行内毒素检测;将Hep ZJ细胞悬液经尾iv进入SD大鼠后观察其生存情况并于不同时间点进行剖检,通实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法分析该细胞系的生物分布;将Hep ZJ细胞悬液sc进入BALB/c-nu裸鼠后分析其致瘤性。结果 Hep ZJ支原体检测电泳图未见阳性条带;内毒素检测浓度<2 EU/m L;SD大鼠尾iv Hep ZJ后生存情况良好,血液、肺脏、脾脏在不同时间点出现不同程度的GAPDH-Human和TERT-Human基因表达,血液中12 h后、肺脏和脾脏中1周后基本被清除,剖检过程中未见肿块形成;裸鼠sc Hep ZJ后无硬性肿物形成。结论新型永生化人肝细胞系Hep ZJ无支原体、细菌污染,进入体内后无明显副反应及致瘤性,具备应用安全性。