软组织肉瘤患者的二代测序(NGS):诊疗价值、与中医药治疗的关系

目的:探索二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术在软组织肉瘤(soft tissue sarcoma,STS)患者中的诊疗价值,并结合NGS技术,探讨潜在的抗肉瘤中医治疗意义。方法:本研究采用NGS技术对30例不同亚型软组织肉瘤患者的肿瘤组织进行全面分析,共包含五个基因层面的检测:肿瘤体细胞变异:651个基因的全部外显子,65个基因的部分内含子;胚系变异:63个基因的全部外显子;肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB);微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI);PD-L1(22C3)蛋白表达。并结合临床实践进行数据解读。结果:肉瘤患者的基因突变主要分布在与细胞周期相关的基因和已知的致癌驱动基因中,其中有1例患者的手术病理诊断得到了NGS报告的修正。超过一半的患者具有可干预性突变,其中4例转移/复发性患者根据NGS报告进行了相应的靶向/免疫治疗,3例患者在临床治疗中获得了疾病控制,无进展生存时间(progression-free survival time,PFS)分别为6、6、12个月。结论:肉瘤组织基因测序可以进一步验证病理诊断;与肿瘤相关的遗传变异为现有的靶向治疗提供了科学依据并增加了新药靶点的发现潜力;报告中对免疫相关指标的检测为软组织肉瘤患者的免疫治疗选择和预后提供了依据;此外,我们还探讨了NGS报告中突变基因与中医治疗机制之间的关系;期望这些数据能够推动未来临床软组织肉瘤的精准/个体化医疗进展。

基于RNA-based NGS检测非小细胞肺癌融合基因临床实践中国专家共识

基于RNA水平的二代测序(RNA-based next-generation sequencing, RNA-based NGS)技术已被非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)临床实践指南和专家共识推荐为融合基因的检测方法之一。NSCLC可用药靶点主要包括基因突变和融合,用于评估靶向治疗可行性的基因突变和融合基因检测均不可或缺。目前,基于DNA水平的NGS(DNA-based NGS)结合RNA-based NGS一次性同步检测基因突变和融合的技术已部分应用于临床实践。然而,RNA-based NGS检测融合基因的应用时机、应用场景和质控方面在我国仍缺乏规范和标准。本共识将进一步明确RNA-based NGS在融合基因检测中的应用时机、应用场景和质控,并给予指导性建议,推动RNA-based NGS在NSCLC临床诊疗中的应用,使患者能够最大程度地从融合基因检测中获益。

尿路上皮癌FGFR基因变异初探

目的探讨尿路上皮癌(UC)成纤维细胞生长因子受体(FGFR)基因变异特征,为筛选潜在获益于FGFR抑制剂的目标人群和制定检测策略提供参考。方法收集40例存档的甲醛固定石蜡包埋的尿路上皮癌组织标本,采用新一代测序技术分析FGFR基因变异。结果在40例尿路上皮癌样本中检出FGFR基因变异10例(25.0%,10/40),包括FGFR2 M538I突变1例、FGFR3 S249C突变4例、FGFR3 R248C突变2例、FGFR3 Y373C突变1例、FGFR3 G548R突变1例及FGFR3 Y373C/FGFR4 K186M双突变1例。其中G548R和K186M突变未见报道。结论尿路上皮癌患者中存在特殊的FGFR变异位点,生物学意义待明确,有必要扩大样本量进一步研究。

利用SSR标记对家蚕卵非胶着性基因(Ng)的定位分析

家蚕卵非胶着性基因(No-glue,Ng)位于第12染色体,Ng突变体的雌性成虫生殖器的粘液腺只分泌极少量的粘性物质,因此产下的卵不能粘着而成为天然散卵,是研究家蚕粘液蛋白分泌机制的重要材料。利用雌性家蚕的W染色体和Z染色体间不发生交换的特点,采用产胶着卵的家蚕品系KY和产非胶着卵的家蚕品系巴格达特(Ba)组配正反交群体(Ba×KY)F1♀×KY♂和KY♀×(Ba×KY)F1♂2种材料,分别记作BC1F和BC1M,根据已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对Ng基因进行连锁分析及定位。BC1F群体中的所有产非胶着卵的个体均表现出与(Ba×KY)F1相同的杂合型带型;而所有产胶着卵个体的带型与亲本KY一致,为纯合型。筛选出4个与Ng基因连锁的SSR标记,并利用BC1M群体构建Ng基因的SSR标记遗传连锁图,连锁图的遗传距离为51.9cM,与Ng基因最近的引物为S1213,图距为0cM。

腺病毒载体介导的lacZ基因在NG细胞系及大鼠黑质的表达

本实验用标记基因ｌａｃＺ５型重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ）转染培养的ＮＧ细胞系，Ｘ－ｇａｌ染色检测转染效率．在培养的ＮＧ细胞系，当病毒滴度为２×１０８时，转集率达到５０％，当滴度为２×１０９时，转染率达１００％，有较好的量效关系；固定病毒液度为１０１０，培养２～１６ｈ，细胞的转染率随时间延长而提高，有较好的时效关系。将Ａｄ５ＣＭＶｌａｃＺ注射到大鼠黑质部位后，分别于注射后３～１２０ｄ取脑、切片、Ｘ－ｇａｌ染色，发现黑质局部从第７ｄ开始有部分蓝染，第１０ｄ达高峰，注射局部感染率１００％；９０ｄ时开始下降，持续至１２０ｄ；纹状体等其它部位无蓝染．上述结果提示，腺病毒载体介导的标记基因可在培养的神经细胞系和中脑黑质部位高效表达，为进一步开展中枢神经系统退变性疾病尤其是帕金森氏病的基因治疗奠定基础。

NGS检测乙型肝炎病毒耐药基因突变情况及其临床意义

目的检测乙型肝炎患者的HBV YMDD突变情况,探究下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)检测HBV耐药基因突变的可行性及患者性别与其YMDD突变的相关性,并为临床用药提供参考。方法运用NGS测序技术对收集的100例临床样本进行HBV YMDD突变的检测,并与临床检测金标准Sanger测序法的测序结果进行比对。结果运用NGS检测100例HBV样本,其中YMDD野生型88例,HBV YMDD耐药基因突变12例,与Sanger测序法的测序结果完全相符。结论本研究结果显示,NGS技术可用于HBV耐药基因突变检测,患者性别与HBV耐药突变无明显相关性。

NGS与常规筛查对地中海贫血基因筛查的结果比较

目的比较高通量测序技术(NGS)与常规筛查方法对地中海贫血基因的筛查效果。方法以进行孕前或孕期检查的405例广东籍夫妇为研究对象,分别采用高通量测序(NGS)技术(观察组)和常规筛查方法(对照组)进行地中海贫血基因筛查,比较两组的检出率、符合率及经济效益。结果通过常规检测、NGS及双脱氧链终止法(Sanger测序)或实时定量基因扩增荧光检测系统(Q-PCR)检测,共确认249例基因检测为阳性,其中α-地贫血基因168例(67.47%),β-地贫基因72例(28.92%),α,β-地贫基因9例(3.61%)。其中对照组检出221例(88.76%),研究组检测出247例(99.20%)。研究组检测23种常规地贫基因的结果与对照组基本一致,但研究组还检测出25例对照组未检测出的7种基因突变类型,与Sanger或Q-PCR验证结果完全一致。观察组基因检测耗时明显长于对照组,费用显著高于对照组(P<0.05)。结论 NGS可提高地中海贫血基因的检出率,筛查范围广,效率高,有利于临床地中海贫血基因的筛查。

基于NGS的弥漫大B细胞淋巴瘤预后相关基因突变研究进展

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一种高度侵袭性的恶性淋巴瘤,发病的分子机制尚未完全明确。二代测序(next generation sequencing,NGS)是一项日趋成熟的基因检测技术,近年来已广泛应用于DLBCL的基因研究。基于上述研究的靶向治疗也取得了一系列进展,使得基因突变在DLBCL中成为新的研究热点。本文就DLBCL预后相关基因突变研究进展进行综述。

NGS快速分析系统的临床应用

目的:建立并探讨二代测序(NGS)快速分析系统在肿瘤数据分析中的临床实用效果。方法:收集500例金域医学2018-2019年NGS标本,以下机数据作为研究对象。对数据分析人员和NGS快速分析系统软件筛选出致病位点的准确度、重复性和耗时进行比对;并分析金域核心系统(KMClient PRD)导出的报告单与NGS快速分析系统导出报告单内容的一致性。结果:快速分析系统分析500例下机数据的结果与人工分析一致,准确性和重复性均达标,在时间上系统比人工的分析速度要快数十倍。另PRD系统与NGS快速分析系统导出报告单的内容差异不明显。结论:NGS快速分析系统可批量快速检出有临床意义的突变,以实现结果快速报告,同时降低人员操作主观出错率,不失为一种新型的一体化数据分析解决模式。

基于NGS方法的基因检测分析肺癌患者治疗前后的基因变化

目的基于NGS方法的基因检测分析肺癌患者的基因变化,以探讨NGS方法的检测对于肺癌患者临床诊断的应用价值。方法选取2017年1月至2018年12月到我院进行诊断并住院治疗的76例初治肺癌患者作为研究对象,收集其治疗前后的临床资料,分析其NGS方法的基因检测结果。结果76例肺癌患者在治疗前及治疗后通过NGS方法检测出的基因位点突变的基因型中EGFR基因均具有最高的突变阳性率;治疗前76例患者中有58例患者存在基因位点突变,基因位点突变共计68个,治疗后之前的58例基因位点突变患者仅18例患者存在基因位点突变,基因位点突变共计28个;基因突变主要以EGFR、KRAS和MET为主;治疗后患者的例数下降,基因位点突变数由于不良反应上升,基因位点突变数与患者例数比率增加,但是整体患者例数呈下降趋势,提示病情改善患者增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NGS基因检测技术在肺癌基因检测中具有独特的优势,可应用于单细胞和游离的循环DNA,可对从组织样本、胸水细胞蜡块、血液样本等多个样本类型中获取的DNA样本进行准确的基因测序与检测,具有极高的灵敏度与特异性,能够推动对肿瘤基因突变的基础和临床研究,降低检测的经济成本,使其能够实现在肺癌患者的临床诊断和治疗中的推广应用。

ARMS与NGS对比检测NSCLC患者标本EGFR、KRAS、BRAF、EML4-ALK融合等基因探索

目的探讨突变扩增阻滞系统(ARMS)法和下一代测序(NGS)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者标本多驱动基因改变上的差异,指导临床个体化治疗。方法51例NSCLC患者标本首先采用ARMS法,对所有样本进行表皮生长因子受体(EGFR)、鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1(BRAF)、棘皮动物微管相关类蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)等基因检测,随后采用NGS对上述标本进行高通量检测对比,收集临床资料,定期随访。结果51例NSCLC样本应用ARMS法与NGS检测EGFR、KRAS、EML4-ALK突变阳性率(48.9%vs53.3%、11.1%vs 8.9%、13.7%vs 5.9%)差异无统计学意义。两种方法检测出的EGFR-19del突变组比EGFR-L858R突变组靶向治疗生存期较长,差异有统计学意义(P=0.010),但两组在性别、年龄、靶向治疗阶段等方面差异无统计学意义。NGS法检测出EGFR-19del、L858R突变患者肿瘤特有基因平均数量分别为7.1、4.6个,EGFR-L858R多为抑癌基因突变(91%)。2例EGFR/KRAS双突变患者较EG-FR单突变患者预后差。结论ARMS法和NGS均适用于NSCLC患者突变驱动基因检测。对于DNA点突变检测,NGS不仅显示ARMS检测的遗漏,还显示突变丰度、伴随突变及非常规突变等,对ARMS检测有补充作用。EGFR-19del患者靶向治疗生存期比EGFR-L858R突变患者长,EGFR-L858R主要为抑癌基因突变。EGFR合并KRAS双突变患者预后较差,但仍需进一步研究证实。

NTRK基因融合阳性甲状腺乳头状癌9例临床病理特征

目的分析NTRK基因融合甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)的组织形态学特征,为分子检测提供形态学依据。方法回顾性收集790例PTC,筛选出NTRK融合阳性病例,通过与经典型PTC组织学特点比较,探讨NTRK基因融合PTC的组织学特征。结果790例PTC检出9例(1.1%)NTRK融合阳性,其中2例NTRK1和7例NTRK3基因融合。组织学特征主要以滤泡状为主,肿瘤呈多灶性渗透或“跳跃式”浸润,胞质伴透明化改变;核膜轻度不规则。结论NTRK基因融合在PTC中的发生率较低,倾向发生于年轻人。组织学以滤泡亚型为主,形态较温和,但侵袭转移能力强,因此及早识别行高通量测序检测,以便早期干预,延长患者生存期。

贵州黔西南地区孕妇地中海贫血的基因突变类型

目的分析黔西南地区孕妇地中海贫血(地贫)的基因突变类型分布、基因频率及特有基因型数据。方法2019年1月—2020年10月20209例孕妇人群,于孕11~38周时采集外周静脉血,采用高通量二代测序技术(NGS)结合跨越断裂点的PCR技术(Gap-PCR)检测血红蛋白地贫基因。结果20209例样本中共检测出地贫基因突变2854例,地贫基因携带率为14.122%;其中α-地贫基因突变1954例,共56种类型(其中有12种类型为新发现的致病性不清楚的变异体,统归为不确定型,基因频率为1.726%),基因频率前3位依次为-α^(3.7)(39.646%)、--^(SEA)(25.398%)、α^(CS)(14.159%);β-地贫基因突变749例,共52种类型(其中有17种类型为新发现的致病性不清楚的变异体,统归为不确定型,基因频率为5.507%),基因频率前三位依次为β^(CD 17(A>T))(40.529%)、β^(CD 41/42(-TTCT))(27.753%)、β^(IVS-II-654(C>T))(7.159%);αβ-复合型地贫突变151例,共45种类型,以αα/-α^(3.7)&β^(CD 17(A>T))/βN多见(36例,构成比23.841%)。结论黔西南州地区α-地贫基因突变类型主要为αα/-α^(3.7),β-地贫基因突变类型主要为β^(CD 17(A>T))/β^(N),并发现多种致病性尚不清楚的新发基因和罕见突变类型,具有地区特异性。

重症新生儿呼吸窘迫综合征早产儿的SFTPA基因多态性分析

目的分析患有重症新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)早产儿SFTPA基因变异情况。方法选择20例胎龄在28周(含)至32周(含)患有重症新生儿呼吸窘迫综合征的早产儿为研究对象,抽取静脉血进行SFTPA基因编码区和内含子连接区高通量测序。结果20例早产儿中,19例患儿检出SFTPA基因位点变异,变异率95%,共检出13个位点变异,其中编码区变异位点8个,内含子区变异位点5个,数据库分析发现c.683G>C及c.-38-30G>C位点变异频率<0.01,变异位点有害性分析显示c.683G>C为意义不明变异,c.-38-30G>C对剪切位点没有影响。结论患有重症RDS的早产儿存在SFTPA基因位点变异,但其致病性尚不明确,有待进一步研究。

犬IGF-I编码区cDNA克隆及其序列分析

目的 :克隆犬胰岛素样生长因子 (IGF -I)编码区基因 ,构建重组真核表达载体。方法 :从犬左心室组织中提取总RNA ,通过RT -PCR获取IGF -1cDNA编码区全序列 ,将其与 pcDNA3 .1(+ )质粒载体连接 ,构建重组真核表达载体pcDNA3 .1(+ ) /IGF -1,转化大肠杆菌DH5α后 ,随机挑选数个克隆 ,提取质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列鉴定阳性克隆。结果 :重组质粒pcDNA3 .1(+ ) /IGF -1的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论 :克隆到IGF -1编码区基因 ,成功构建重组真核表达载体 pcDNA3 .1(+ ) /IGF -1。

儿童髓母细胞瘤脑脊液循环肿瘤DNA检测可行性分析

目的应用二代测序对比髓母细胞瘤肿瘤组织和脑脊液循环肿瘤DNA的基因分析结果,确定脑脊液液态活检的可行性。方法针对2019年4-12月北京天坛医院小儿神经外科收治的6例术前依据头颅核磁影像学诊断并术后病理确诊为髓母细胞瘤的患儿,术中留取脑脊液标本及外周血,以及同期于我院住院初治、影像明确脊髓播散的髓母细胞瘤患儿1例,术后3~4周行腰椎穿刺留取脑脊液标本同时留取外周血标本,应用二代测序对比髓母细胞瘤肿瘤组织和脑脊液循环肿瘤DNA的基因分析结果。结果3例提取质控不合格,4例患儿脑脊液循环肿瘤DNA检测阳性率75%。脑脊液检测出KMT2D、KMT2C、TP53、NF1、PIK3CA、SMARCA4、KMD5A等髓母细胞瘤相关基因突变,组织检测出KMT2D、SMARCA4等髓母细胞瘤相关基因突变。结论脑脊液循环肿瘤DNA检测脑脊液上清可能较组织检出更丰富的基因突变。

移植心脏病理学诊断标准及其进展

随着心脏移植外科技术的提高和强效免疫抑制剂的临床应用,心脏移植例数和移植心脏存活时间均显著提升。然而在心脏移植术后的不同阶段,仍然可出现移植心脏右心室衰竭、缺血-再灌注损伤、急性排斥反应、“Quilty病变”、感染和以移植心脏冠状动脉血管病(TCAD)为特征的慢性排斥反应等一系列并发症。心内膜心肌活组织检查(EMB)技术的应用使得包括排斥反应在内的移植心脏多种并发症的病理学特征得以观察和掌握,并成为移植心脏并发症最为准确的诊断手段。本文对移植心脏病理学研究的简史、心脏移植术后主要并发症及其诊断标准以及移植心脏排斥反应诊断研究的最新进展进行阐述,旨在使更多的心脏移植受者受益。

肾素血管紧张素系统基因多态性与冠心病关系的研究

目的 :探讨中国苏皖地区人群血管紧张素转换酶 ( ACE)和血管紧张素原 ( AGT)基因型的分布及其与冠心病的关系。方法 :应用聚合酶链反应技术 ,对 10 6例冠心病患者、5 6例冠状动脉造影正常者以及 3 0名健康献血员 ACE插入 /缺失 ( I/ D)多态性及AGTM2 3 5 T多态性进行检测。结果 :ACE基因型分布及等位基因频率在病例组及对照组间差异无显著性。病例组和对照组 AGT基因型总体分布差异亦无显著性 ,而病例组 T等位基因频率 ( 0 .778)显著高于对照组 ( 0 .698,P<0 .0 5 )。联合分析 ACE DD型及 AGTTT型罹患冠心病的相对风险 ,其比数比 ( OR)为 3 .61,高于单基因 ACE DD型 ( 1.2 3 )及 AGT TT型 ( 1.77)。结论 :AGTM2 3 5 T基因多态性中 T等位基因是中国苏皖地区人群冠心病发病的危险因素之一。同时具有 ACE DD型及 AGT TT型发生冠心病的相对风险显著高于单基因 ACE DD型及单基因 AGT TT型。

HPRT1基因相关神经系统异常综合征1例报告

目的探讨HPRT1基因相关的神经系统异常综合征(HRND)的临床表现及基因突变特点。方法回顾分析1例以发育迟缓、高尿酸血症为表现的HRND患儿的临床资料及基因全外显子测序和验证结果。复习文献,比较相似基因型患者的临床表型,并在RNA水平探讨基因突变对蛋白功能的影响。结果患儿,男,3岁4个月。面容未见异常,语言、运动发育均落后,四肢活动受限,双下肢可部分持重,双足外翻,四肢肌力低下,活动及情绪紧张时四肢肌张力增高,不自主动作增多。尿酸1404.7μmol/L,Y痕迹蛋白1.64 mg/L,乳酸脱氢酶539 U/L,乳酸脱氢酶同工酶84 U/L。脑电图、肌电图、头颅磁共振未见明显异常。全外显子测序结果显示,HPRT1基因存在c.319-2A>T剪接位点突变,其母亲为携带者,该突变可导致HPRT1基因编码的RNA错误加工(缺少外显子3)。结论HPRT1基因c.319-2A>T剪接突变是导致HRND的遗传病因,全外显子测序技术可协助临床确诊。

一氧化氮对肿瘤细胞辐射敏感性的影响研究

调节肿瘤细胞中一氧化氮(Nitrogenmonoxide,NO)的合成量,观察NO对细胞辐射敏感性的影响。结果显示乏氧和L-甲基盐酸精氨酸(L-NG-Monomethylargininehydrochloride,L-NMMA)作用均可显著抑制NO的合成,但对一氧化氮合酶(Induciblenitrogenmonoxidesynthase,iNOS)活性无显著影响;NO可以增强肿瘤细胞对射线的敏感性也增强,但两者变化并非线性相关;乏氧和L-NMMA作用抑制肿瘤细胞中NO的合成,会降低细胞对射线的敏感性;同母本细胞相比,基因转染建立NO含量较高的肿瘤细胞,氧增比(OxygenEnhancementRatio,ORE)下降,提示NO参与射线引起的细胞损伤。