人α-防御素-3基因乳腺特异性表达载体的构建及在兔乳腺中的瞬时表达

为探索人α-防御素-3(HNP-3)基因在兔乳腺中特异性表达的可行性,将HNP-3基因与大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5′端调控区序列融合,定向克隆到PEGFP-1表达载体EGFP基因上游,在EGFP基因3′端加上His标签蛋白基因序列,构建了HNP-3基因乳腺定位表达载体pEGFP-WAP-HNP-S,将pEGFP-WAP-HNP-S与脂质体包裹后通过乳腺导管注射法转入妊娠母兔乳腺中,Westernblot和ELISA检测HNP-3融合基因在乳腺中表达和融合蛋白的表达水平,并用Ni亲和层析柱进行纯化。结果表明:分娩后初乳中即有分子质量为40kD的HNP-3融合蛋白表达,分娩后第4d达到高峰,表达量为265ng/mL。实验证明HNP-3融合基因在乳腺组织中能够特异性的表达。

抗小鼠H-Y抗原IgY抗体的纯化

用 Ni-NTA 柱纯化 SMCY 重组蛋白,将该蛋白作为配基偶联至 CNBr 活化的 Sepharose 4B制成亲和层析柱,分离纯化抗 H-Y 抗原的特异性 IgY 抗体。结果表明:Ni-NTA 柱纯化后,SMCY 重组蛋白纯度可达到80%左右;亲和层析柱纯化可以使IgY 抗体的纯度达到97%,经免疫组化检测,该抗体能够结合与雄性小鼠肝脏细胞表面,而不与雌性小鼠肝脏细胞发生结合。证实了经过纯化得到的高纯度 IgY 抗体具有很好的抗 H-Y 抗原特异性。通过该方法可纯化分离得到高纯度抗 H-Y 抗原 IgY 抗体。

游仆虫第一类肽链释放因子在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

为对肽链释放因子结构与功能进行研究 ,进而探讨纤毛虫这类生物中遗传密码表达特殊性的机理 ,利用PCR技术和基因重组技术构建了游仆虫第 1类肽链释放因子eRF1a及C端带 6个组氨酸的eRF1a(His) 6的两个重组表达质粒pBV2 2 1 eRF1a和pBV2 2 1 eRF1a(His) 6.在大肠杆菌DH5α中 ,通过 4 2℃高温诱导 3h ,eRF1a和eRF1a(His) 6获得了可溶性表达 .eRF1a(His) 6的表达水平达到可溶性细菌总蛋白约 8% ,经Ni NTA亲和层析和HitrapQ离子交换层析 ,得到纯度较好的eRF1a(His) 6.

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。

海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯

克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2

基因工程菌1020耐热木聚糖酶的纯化

目的:提纯基因工程菌1020耐热木聚糖酶。方法:超声破碎细胞,而后经过热变性处理和Ni-NTA亲和层析分离纯化。结果:根据pET System Manual的方法分析木聚糖酶主要分布在可溶性细胞质中;超声破壁功率400W,破碎15min时效果最佳;粗酶液经过70℃,热变性30min处理后,纯化倍数达到4.9;采用Ni-NTA Sephrose F.F一步层析可以得到电泳纯的木聚糖酶,纯化倍数13.4,得率29.4%。结论:热变性处理是一种有效的提纯手段,合理的条件可以使纯化倍数提高;Ni-NTA亲和层析是纯化含His标签的目的酶的特异高效纯化方法。

水稻cDNAc73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

曾以水稻蜡质基因５’调控区内一段３１ ｂｐ 片段为探针，用酵母单杂交法从水稻ｃＤＮＡ 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此３１ ｂｐ 片段结合的ｃＤＮＡ克隆，现将其中的ｐＣ７３ 克隆中的插入片段ｃ７３ 连接到含Ｈｉｓ６ 的表达载体ｐＥＴ２８ｃ（ ＋ ） 上，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行诱导表达，并用ＮｉＮＴＡ 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下，融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内；表达量占到大肠杆菌总蛋白的１０ ％ 左右；经ＮｉＮＴＡ 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达９５ ％ ，可供进一步研究之用。

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。

抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定

目的在大肠杆菌中融合表达抗菌肽cecropin P1。方法根据抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列,依照大肠杆菌密码子的偏爱性,采用SOE技术合成cecropin P1的编码基因;将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,经IPTG诱导表达,超声上清液用Ni-NTA亲和层析初步纯化,经肠激酶切割后,用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法初步测定重组cecropin P1的活性。结果构建得表达质粒pET32-P1,经IPTG诱导表达获得融合蛋白TrxA-cecropin P1,占总蛋白质25%以上;纯化产物经肠激酶切割后,Tricine-SDS-PAGE显示成功释放抗菌肽cecropin P1;初步测定结果显示其有抑菌活性。结论本研究为研发重组抗菌肽cecropin P1的生产工艺奠定了基础。

甲基对硫磷水解酶纯化与保存

对带有重组表达质粒E.coli菌种进行了扩大培养,在IPTG的诱导下大量表达,获得了C-末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶。经Ni-NTA亲和层析获得了具有较高生物活性的甲基对硫磷水解酶。本文对该酶纯化的梯度洗脱条件和酶动力学进行了考察,并通过环境对酶活性的影响检测,确定了将酶制备成冻干粉,更利于保存。

人载脂蛋白A1的表达、纯化与羊多抗血清制备

目的:载脂蛋白A1(ApoA1)可促进胆固醇的代谢,作为动脉硬化预防因子而受到重视,在临床检测中具有重要意义。目前载脂蛋白A1测定试剂盒在各大医院普遍使用的是进口试剂,检验成本高。本研究旨在为国产载脂蛋白A1检验试剂的研发提供理论基础。方法:将载脂蛋白A1基因克隆至p ET-28a载体进行表达,利用离子交换层析与Ni-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白,纯化后的载脂蛋白A1免疫山羊,获得羊多抗血清。结果:重组载脂蛋白A1以可溶形式表达,纯度达到95%以上,将纯化后的载脂蛋白A1免疫山羊,间接ELisa免疫效价达到1∶100000以上,经双向扩散法测定效价达到1∶16。结论:本文制备的羊抗血清可用于载脂蛋白A1的检测,可为ApoA1检测试剂盒提供技术参考。

青海血蜱唾液腺重组Hq001蛋白表达及纯化条件的优化

目的对青海血蜱唾液腺重组Hq001蛋白的表达条件(表达菌株及诱导条件)及纯化方式(非变性及变性纯化)进行优化。方法将重组质粒pET-30a-Hq001分别转化至不同感受态菌株[E.coil BL21(DE3)、E.coil Rosetta(DE3)、E.coil ArcticExpress(DE3)pRARE2],确定最适表达菌株后,对IPTG终浓度(0、0.5、1.0 mmol/L)、诱导温度(20、25℃)及诱导时间(0、2、4、6、8 h)进行优化。最佳诱导条件表达的菌体经高压均质破碎后,采用非变性(变性-复性-过柱)及变性(变性-过柱-复性)两种方式进行Ni-NTA亲和层析纯化。表达及纯化产物均经12%SDS-PAGE分析。结果重组Hq001蛋白最适表达菌株为感受态E.coil BL21(DE3);最适诱导条件为:IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间4 h。非变性纯化方式可获得相对分子质量约为18800的目的蛋白,大小与预期相符。结论采用优化的表达条件及纯化方式可获得青海血蜱唾液腺重组rHq001蛋白。

包涵体重组蛋白不同纯化方法的比较

目的比较切胶、包涵体复性及Ni-NTA亲和层析3种方法纯化包涵体重组蛋白的效果。方法筛选全长IL-1β与全长IL-1Ra重组质粒(简称IL-1β-1Ra-2重组质粒)及全长IL-1Ra重组质粒的转化感受态菌株[感受态E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)PLysS及E.coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL]、IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L)、诱导温度(16和37℃)。最佳表达条件诱导的IL-1β-1Ra-2重组质粒,分别用切胶、包涵体复性及Ni-NTA亲和层析法进行纯化,确定最佳纯化方法。采用最佳表达条件分别诱导表达IL-1β-1Ra-2重组质粒及全长IL-1Ra重组质粒后,通过最佳纯化方法进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果IL-1β-1Ra-2重组质粒及全长IL-1Ra重组质粒最佳转化感受态菌株为E.coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL,最佳IPTG浓度分别为1和0.4 mmol/L,诱导温度为37℃;最佳纯化方法为包涵体复性纯化法。IL-1β-1Ra-2及全长IL-1Ra重组蛋白包涵体复性纯化产物相对分子质量分别约为10560和19770,纯度可达90%以上,可溶性蛋白回收量分别约为46及63 mg,且均可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。结论相同条件下,包涵体复性纯化法获得的可溶性蛋白回收量最大,适用于相对分子质量约10000的非高表达包涵体蛋白的纯化。

重组人胱抑素C重链单域抗体的制备

研究在大肠杆菌中表达重组人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)重链单域抗体(Variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody,VHH),经纯化和复性后,建立测定人血清Cys C的胶乳增强免疫比浊法(Particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)。根据大肠杆菌编码蛋白的特性设计Cys C重链单域抗体编码基因序列,人工合成目的基因克隆至PET32a(+)载体中,构建重组人Cys C重链单域抗体原核表达质粒PET32a(+)-Cys C重链单域抗体,测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,所获得的目的抗体经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,通过稀释复性,SDS-PAGE鉴定其纯度。Cys C重链单域抗体化学偶联胶乳颗粒,建立PETIA法测定人血清Cys C。SDS-PAGE电泳分析显示,表达的Cys C重链单域抗体相对分子质量约为53 k,经Ni-NTA亲和层析法纯化后抗体纯度达90%以上,复性回收率为60%左右。用Cys C重链单域抗体建立的测定人血清Cys C的PETIA,能检测到血清中的Cys C含量。成功构建Cys C重链单域抗体原核表达系统并获得了有活性的Cys C重链单域抗体,该抗体可用于建立测定Cys C的PETIA法,为下一步开发Cys C的免疫检测试剂盒奠定了基础。

重组肉毒神经毒素A轻链(BoNT/ALC)蛋白的表达、纯化与鉴定

目的:克隆、表达并纯化肉毒神经毒素A轻链(BoNT/ALC)片段,为BoNT/A的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法:以PCR方法自肉毒梭菌中扩增BoNT/A轻链基因,直接插入pGEM T载体,测序正确后再与表达载体pET21a构建重组表达载体pET21a 轻链,转化E.coliBL21(pLys)感受态细胞获得表达工程菌株并进行诱导表达,用Western印迹鉴定重组BoNT/A轻链。结果:经PCR获得的BoNT/A轻链序列与GenBank中的BoNT/A轻链基因序列的一致性达 99. 9%以上。表达工程菌BL21 /pET21a ALC于 37℃经 0. 7mmol/LIPTG诱导 6h,目的蛋白获得高表达,约占菌体总蛋白的 23%。经过镍离子螯合次氨基三乙酸 (Ni NTA)亲和层析一步纯化,重组BoNT/A轻链的纯度可达 97%以上。Western印迹结果表明,重组BoNT/A轻链与抗天然BoNT/A的马血清发生特异性的抗原抗体结合反应。结论:成功克隆、表达并纯化了BoNT/A轻链片段,其抗原性良好。