NGAL蛋白Ni^(2+)-金属鏊合层析纯化及其鉴定

背景与目的 :通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2 +_金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定 ,最后获得一定丰度与纯度的NGAL蛋白。 材料与方法 :将 pDsbA2.0 -NGAL融合表达载体转化大肠杆菌 ,进行IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE分析表达产物的产量与可溶性 ,然后将表达产物进行Ni2 + _金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定。 结果 :将 pDs bA2.0 -NGAL融合表达载体进行IPTG诱导表达 ,SDS-PAGE分析显示表达的NGAL融合蛋白产量高、可溶性好 ;对表达的NGAL蛋白进行Ni2 + _金属鏊合层析纯化后其纯度>95 %,MALDI-TOF-MS鉴定结果提示纯化后NGAL蛋白分子量与其理论分子量的误差仅为0.91‰。结论 :通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2 + _金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定 ,最后确切获得了一定丰度电泳纯的NGAL蛋白 。

游仆虫第一类肽链释放因子在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

为对肽链释放因子结构与功能进行研究 ,进而探讨纤毛虫这类生物中遗传密码表达特殊性的机理 ,利用PCR技术和基因重组技术构建了游仆虫第 1类肽链释放因子eRF1a及C端带 6个组氨酸的eRF1a(His) 6的两个重组表达质粒pBV2 2 1 eRF1a和pBV2 2 1 eRF1a(His) 6.在大肠杆菌DH5α中 ,通过 4 2℃高温诱导 3h ,eRF1a和eRF1a(His) 6获得了可溶性表达 .eRF1a(His) 6的表达水平达到可溶性细菌总蛋白约 8% ,经Ni NTA亲和层析和HitrapQ离子交换层析 ,得到纯度较好的eRF1a(His) 6.

一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

从Bacillus subtilis L5-20染色体上克隆得到ALDC基因alsD,构建重组表达载体pMA5-alsD-His,将其转化到B.subtilis WB600中。SDS-PAGE结果显示ALDC在重组B.subtilisWB600中成功表达,其相对分子质量(Mr)为32×103。采用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC,所得纯酶的比酶活为272.3 U/mg,总回收率为89.8%。该重组ALDC最适反应温度仅为25℃,在20～35℃范围内均表现出较高的活性。Ni2+对ALDC有一定的激活作用,Fe3+使ALDC活性完全丧失。经摇瓶培养,重组菌的ALDC酶活为27.0 U/mL,约为出发菌酶活的70倍。经5 L的发酵罐发酵放大试验,ALDC酶活最高可达75.9 U/mL。

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。

重组hKGF2原核表达载体的构建及其蛋白质的纯化

角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor2,KGF2)是新近发现的成纤维细胞生长因子家族中的一员,又称FGF10,是上皮细胞特异性的促有丝分裂剂,具有广泛的应用前景。为构建其高效原核表达体系,用RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取成熟hKGF2cDNA,进行T-A克隆;经测序后,构建pET-30a(+)-hKGF2重组表达载体,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定为高效可溶性表达。镍亲和层析(Ni+-NTA)一步法纯化后获得纯度达95%以上的目的蛋白,生物活性研究表明,重组hKGF2能有效促进人胚胎肾上皮细胞的增殖。

海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯

克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2

基因工程菌1020耐热木聚糖酶的纯化

目的:提纯基因工程菌1020耐热木聚糖酶。方法:超声破碎细胞,而后经过热变性处理和Ni-NTA亲和层析分离纯化。结果:根据pET System Manual的方法分析木聚糖酶主要分布在可溶性细胞质中;超声破壁功率400W,破碎15min时效果最佳;粗酶液经过70℃,热变性30min处理后,纯化倍数达到4.9;采用Ni-NTA Sephrose F.F一步层析可以得到电泳纯的木聚糖酶,纯化倍数13.4,得率29.4%。结论:热变性处理是一种有效的提纯手段,合理的条件可以使纯化倍数提高;Ni-NTA亲和层析是纯化含His标签的目的酶的特异高效纯化方法。

组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

通过改变终止密码子位点，在一个耐热木聚糖酶突变株DSB的C末端添加了6聚组氨酸标签（ His-tag ），并完成了表达和酶特性鉴定．通过PCR将嗜热真菌DSM 10635来源的木聚糖酶突变体基因dsb的终止密码子序列定点突变为谷氨酸密码子序列，连接到表达载体pET-22b（＋），转化Escherichia coli．BL21（DE3），诱导表达的耐热木聚糖酶DSB在C端含有6×His-tag．表达产物经硫酸铵分级沉淀和Ni Sepharose层析纯化，获得了电泳纯重组酶DSB．结果表明：添加组氨酸标签的酶与原始酶相比，酶学特性无变化．SDS-PAGE电泳结果显示该酶分子量约为23 kDa，重组酶最适pH为6．5，最适温度为75℃，在pH 5～10具有良好的稳定性，在pH 6．5，70℃条件下处理30 min相对酶活力仍保留80％以上．

水稻cDNAc73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

曾以水稻蜡质基因５’调控区内一段３１ ｂｐ 片段为探针，用酵母单杂交法从水稻ｃＤＮＡ 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此３１ ｂｐ 片段结合的ｃＤＮＡ克隆，现将其中的ｐＣ７３ 克隆中的插入片段ｃ７３ 连接到含Ｈｉｓ６ 的表达载体ｐＥＴ２８ｃ（ ＋ ） 上，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行诱导表达，并用ＮｉＮＴＡ 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下，融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内；表达量占到大肠杆菌总蛋白的１０ ％ 左右；经ＮｉＮＴＡ 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达９５ ％ ，可供进一步研究之用。

人α-防御素-3基因乳腺特异性表达载体的构建及在兔乳腺中的瞬时表达

为探索人α-防御素-3(HNP-3)基因在兔乳腺中特异性表达的可行性,将HNP-3基因与大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5′端调控区序列融合,定向克隆到PEGFP-1表达载体EGFP基因上游,在EGFP基因3′端加上His标签蛋白基因序列,构建了HNP-3基因乳腺定位表达载体pEGFP-WAP-HNP-S,将pEGFP-WAP-HNP-S与脂质体包裹后通过乳腺导管注射法转入妊娠母兔乳腺中,Westernblot和ELISA检测HNP-3融合基因在乳腺中表达和融合蛋白的表达水平,并用Ni亲和层析柱进行纯化。结果表明:分娩后初乳中即有分子质量为40kD的HNP-3融合蛋白表达,分娩后第4d达到高峰,表达量为265ng/mL。实验证明HNP-3融合基因在乳腺组织中能够特异性的表达。

C端带多聚组氨酸标签的重组小鼠基质细胞衍生因子-1α原核系统的表达及分离纯化

在构建SDF-1原核表达系统的基础上,探索对其活性表达产物分离纯化的技术路线。将从小鼠骨髓组织克隆出的SDF-1α成熟肽基因插入原核表达质粒pET101/D-TOPO,用以转化大肠杆菌BL21Star^(TM)菌株,经IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测证实:其表达产物在约11.6kD处有明显条带显示,其大小与预测的重组SDF-1α/His分子量一致。采用Ni^2+-Resin固相亲和层析法对由该系统表达的C端带6Xhis标签的重组SDF-1α/His进行分离纯化,纯度达92％。体外活性检测结果表明:重组小鼠SDF-1α/His对T细胞有明显趋化和促生存作用;能有效诱导Jurkat细胞ERK磷酸化。

真姬菇热激蛋白70(HmHSP70)的纯化

SDS-PAGE电泳分析显示,经过不同浓度梯度的IPTG诱导,获得了带有重组质粒pET32a-c(+)/HmH-SP70的大肠杆菌产生可溶性重组蛋白的最佳诱导条件。当IPTG的终浓度为0.15mmol/L时,诱导可溶性重组蛋白的量最高,重组蛋白浓度为22.5mg/ml。同时SDS-PAGE显示得到蛋白分子量约为90KDa的融合蛋白。并对诱导过程中产生的包涵体进行了变性和透析复性,使其变为可溶性蛋白;通过镍亲和层析的纯化以及肠激酶的酶切作用,最终得到纯度较高的HmHSP70,纯化后的目的蛋白分子质量约为70KDa,与预期结果吻合。

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。

重组羧肽酶原B的复性方法研究

构建的羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中获得高表达。但目的蛋白是以包涵体的形式存在。为了获得活性羧肽酶B,必须对其包涵体进行变复性。首先利用稀释复性确定了羧肽酶原B复性的最佳缓冲液;在凝胶过滤复性中,研究了柱长和洗脱流速对羧肽酶原B复性效率的影响;另外对比了稀释复性、透析复性、凝胶层析复性和Ni2+亲合层析法等四种方法对羧肽酶原B的复性效果。结果发现,这4种方法的复性效果有以下顺序:凝胶过滤复性>稀释复性>Ni2+亲合层析>透析复性。

CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。

抗小鼠H-Y抗原IgY抗体的纯化

用 Ni-NTA 柱纯化 SMCY 重组蛋白,将该蛋白作为配基偶联至 CNBr 活化的 Sepharose 4B制成亲和层析柱,分离纯化抗 H-Y 抗原的特异性 IgY 抗体。结果表明:Ni-NTA 柱纯化后,SMCY 重组蛋白纯度可达到80%左右;亲和层析柱纯化可以使IgY 抗体的纯度达到97%,经免疫组化检测,该抗体能够结合与雄性小鼠肝脏细胞表面,而不与雌性小鼠肝脏细胞发生结合。证实了经过纯化得到的高纯度 IgY 抗体具有很好的抗 H-Y 抗原特异性。通过该方法可纯化分离得到高纯度抗 H-Y 抗原 IgY 抗体。

布鲁氏菌BP26蛋白的原核表达及鉴定

为了实现布鲁氏菌BP26蛋白在原核宿主细胞进行高效表达,对布鲁氏菌BP26基因进行密码子优化,化学合成了BP26全基因,并将其克隆至pET30a(+)载体上,构建重组质粒pET30a(+)-bp26,转化至基因工程菌BL21(DE3),利用IPTG进行诱导表达。利用His-tag镍柱纯化BP26重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果显示:重组质粒经Nde I与Xhol I双酶切,酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳显示与目的产物条带大小一致;当诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L,37℃诱导8 h时,重组蛋白的表达量最高;纯化后的目的蛋白经过Western Blot鉴定,显示在27.8 kD左右有一条明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。本研究成功实现了在大肠杆菌高效表达BP26蛋白,为后续布病检测新试剂的研制及疫苗的研发奠定了生物学基础。

JC病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达及纯化

目的构建JC病毒衣壳蛋白VP1基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化该蛋白。方法用PCR方法扩增患者尿液中JC病毒衣壳蛋白VP1的基因,测序正确后将其克隆入pET-32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达VP1融合蛋白。大量表达该融合蛋白并用镍柱亲和层析法纯化。结果成功构建重组表达载体,30℃,IPTG诱导可见有融合蛋白表达,存在形式为包涵体。该融合蛋白相对分子质量约为59kDa。Western blot证明融合蛋白具有很好的抗原性。用镍柱亲和层析法成功纯化出VP1融合蛋白。结论成功表达VP1融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。

抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定

目的在大肠杆菌中融合表达抗菌肽cecropin P1。方法根据抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列,依照大肠杆菌密码子的偏爱性,采用SOE技术合成cecropin P1的编码基因;将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,经IPTG诱导表达,超声上清液用Ni-NTA亲和层析初步纯化,经肠激酶切割后,用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法初步测定重组cecropin P1的活性。结果构建得表达质粒pET32-P1,经IPTG诱导表达获得融合蛋白TrxA-cecropin P1,占总蛋白质25%以上;纯化产物经肠激酶切割后,Tricine-SDS-PAGE显示成功释放抗菌肽cecropin P1;初步测定结果显示其有抑菌活性。结论本研究为研发重组抗菌肽cecropin P1的生产工艺奠定了基础。