NMHC Ⅱ A在前列腺癌转移中的作用及lncRNA调控轴筛选

目的研究NMHCⅡA在前列腺癌转移中的作用并筛选其相关lncRNA调控轴。方法使用Oncomine数据库分析前列腺癌中NMHCⅡA编码基因MYH9的mRNA表达水平。通过Western bolt检测良性前列腺增生细胞系BPH-1、前列腺癌细胞系PC3及其高转移型亚细胞系PC3M中NMHCⅡA的蛋白表达水平。构建沉默NMHCⅡA的PC3M细胞,筛选稳定感染细胞株,使用Western bolt及细胞免疫荧光染色鉴定沉默效果。CCK-8检测法测定细胞增殖能力,Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。R语言筛选TCGA数据库中前列腺癌转录组数据,得到异常表达的lncRNA和miRNA并配对;miRcode、miRDB和Targetscan数据库在线预测靶向MYH9的miRNA,比对在线预测结果与TCGA数据库筛选结果,得到共有的miRNA,并根据lncRNA与miRNA配对结果明确miRNA上游的lncRNA,进而推测lncRNA/miRNA/MYH9调控轴。结果Oncomine数据库分析显示,MYH9在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P<0.05)。Western bolt结果证明与BPH-1相比,NMHCⅡA在前列腺癌细胞PC3以及PC3M细胞中表达增高(P<0.05)。shMYH9 PC3M细胞的NMHCⅡA表达水平显著低于无感染组和空载组(P<0.05)。shMYH9 PC3M细胞增殖能力显著低于无感染组和空载组(P<0.05),迁移和侵袭能力也明显低于空载组与无感染组(P<0.05)。数据库筛选结果显示,KIAA0087/miR-133b/MYH9、HNF1A-AS1/miR-133b/MYH9和CACNA1C-IT3/miR-133b/MYH9轴可能在前列腺癌中发挥调节NMHCⅡA的作用。结论NMHCⅡA可能通过靶向前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力调节前列腺癌的转移;KIAA0087/miR-133b/MYH9、HNF1A-AS1/miR-133b/MYH9和CACNA1C-IT3/miR-133b/MYH9这3条调控轴可能调控NMHCⅡA。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。

1例非肌性肌球蛋白重链9基因相关疾病家系并文献复习

目的鉴定1例非肌性肌球蛋白重链9(MYH9)基因相关疾病家系的致病突变。方法调查收集先证者和家系成员病史资料,观察其临床特征和实验室检查指标。采用芯片捕获高通量测序方法检测先证者MYH9基因,确定突变位点后,对先证者和家系成员进行Sanger验证。结果该家系三代4名患者均有鼻衄、瘀斑紫癜、外伤血肿或月经量增多病史,长期存在镜下血尿和蛋白尿。血涂片镜检均有血小板减少、巨大血小板和粒细胞异常包涵体“三联征”。所有患者MYH9基因第40内含子供体剪接位点存在错义突变c.5765+2T>A(p.R1922Rfs*43),且该基因突变与疾病表型共分离。结论该家系存在MYH9基因c.5765+2T>A(p.R1922Rfs*43)剪接突变,是MYH9基因相关疾病的致病突变,为国内首次报道。

非肌球蛋白重链9相关疾病大家系患者中性粒细胞包含体特点分析

目的分析一非肌球蛋白重链9相关疾病(MYH9-RD)大家系患者中性粒细胞包涵体的形态和结构特点,阐明MYH9-RD中性粒细胞包涵体形成的特点,以探讨MYH9-RD中性粒细胞包涵体的致病机制。方法应用光学显微镜(瑞姬染色)和电子显微镜观察中性粒细胞包涵体形态和超微结构特点;应用间接免疫荧光复染技术观察MYH9-RD患者与正常对照者之间非肌性肌球蛋白IIA(NMMHC-IIA)在胞浆中的分布情况。结果光学显微镜和电子显微镜下可见中性粒细胞中明显的包涵体,形态多样,大多位于细胞边缘;间接免疫荧光复染技术显示患者和正常人之间NMMHC-IIA在中性粒细胞中的分布有差异,中性粒细胞胞浆中存在明显绿色荧光的包涵体,其形态和轮廓与瑞一姬氏染色显示的包涵体形状、大小基本一致,但更为清晰;正常对照的粒细胞胞浆中未见包涵体。结论光学显微镜和电子显微镜进一步确认了家系患者包涵体的存在。免疫荧光技术显示患者和正常人之间NMMHC-IIA在中性粒细胞中的分布有差异;MYH9-RD患者中性粒细胞包涵体的主要构成成份是NMMHC-IIA;包涵体的形态结构复杂多样可能与本家系临床表型复杂多样有关,该家系对进一步揭示MYH9-RD的致病机制具有重要的意义。

非肌性肌球蛋白重链9基因相关疾病2例报告并文献复习

目的探讨非肌性肌球蛋白重链9基因相关疾病(MYH9-RD)的基因突变及临床特征.方法回顾分析同一家系2例MYH9-RD患者的临床资料,并复习相关文献.结果先证者(男,1岁5个月)及其父亲(30岁)均有巨大血小板、血小板减少和粒细胞内包涵体,先证者之父还存在神经性耳聋,均曾误诊免疫性血小板减少症,接受激素治疗无效.先证者及其父亲存在MYH9基因c.4270G>A杂合突变,导致氨基酸改变p.D1424N,为错义突变.国内已报道48个家系MYH9-RD,38个有基因测序结果,其中c.4270G>A(p.D1424N)为国内报道最多的MYH9基因突变类型.结论结合细胞形态学及基因检测有利于MYH9-RD的早期诊断,c.4270G>A(p.D1424N)为国内最为常见的MYH9基因突变类型.

一常染色体显性May-Hegglin异常家系致病基因的突变分析

目的分析1个May-Hegglin异常（May-Hegglinanomaly，MHA）家系的表型特点及非肌性肌球蛋白重链9基因（MyH9）突变的类型。方法对先证者及其家系成员进行详细的临床检查和血细胞镜检等实验室检查。采集家系成员的外周血，提取基因组DNA。用PCR技术扩增先证者MyH9基因第10、25、26、30、38、40外显子，测序并分析PCR产物的核苷酸序列。确定突变位点后，利用1对错配引物分别扩增家系中的其余患者及正常成员的对应基因区域，之后进行PCR扩增片段的TaqI限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳图谱分析，以资对照和鉴定。结果本家系中MHA患者具有典型的“血小板减少、巨大血小板、粒细胞包涵体”三联征。所有患者在MYH9基因的第38外显子第5521位核苷酸均存在杂合错义突变C．5521G〉A（P．Glul841Lys），且该突变与疾病表型共分离。结论该MHA家系的致病基因为MYH9。C．5521G〉A突变为中国人群的一个突变热点。

一个MYH9基因相关性血小板减少症家系的基因突变分析

目的分析1个MYH9基因相关性血小板减少症家系的临床特征和突变类型，了解其发病原因。方法对该家系29名成员进行详细的体征检查和并发症及既往史调查，并应用PCR扩增先证者MYH9基因第1～40外显子及外显子与内含子连接区，对产物进行Sanger测序，将测序结果与UCSC数据库人类MYH9基因正常序列对比。确定突变位点后，对29名成员第30外显子进行Sanger测序验证。结果该家系患者的表型存在明显的异质性，4例患者有听力下降或耳聋表现，2例患者有肾炎或肾衰竭表现，其余8例患者无明显症状或仅表现为轻度出血症状。测序结果显示家系的9例患者MYH9基因第30外显子存在C．4270G〉A（p．Asp1424Asn）突变且与疾病表型共分离。结论MYH9基因第30外显子c．4270G〉A错义突变是导致该家系发病的原因。

非家族性May—Hegglin异常伴MYH9基因R1933X突变及I1626V多态性

目的鉴定1例May—Hegglin异常（MHA）先证者非肌性肌球蛋白重链9基因（MYH9）突变类型，并对其无临床及血液学表型的家系成员进行基因分析，以确定先证者MYH9基因突变与其父母该基因遗传的非相关性。方法用透射电镜观察先证者外周血粒细胞包涵体，用扫描电镜观察患者外周血巨大血小板形态；用PCR技术扩增患者及其父母MYH9基因突变热点区域，并对PCR产物进行正反向测序，确定其突变位点。结果①先证者具有典型的“血小板减少、巨大血小板、中性粒细胞包涵体”三联征，MHA诊断成立；而患者父母及兄长均健康。②透射及扫描电镜观察证实先证者外周血存在巨大血小板及粒细胞包涵体。③先证者MYH9基因40号外显子第5797位核苷酸存在C→T突变，该突变导致编码的非肌性肌球蛋白重链ⅡA（NMMHC—A）蛋白第1933位精氨酸转变为终止密码子（R1933X）；先证者MYH9基因33号外显子存在4876A→G杂合突变；先证者父母均未检测出R1933X突变，其母不存在4876A→G多态性，其父为4876A→G多态性的纯合子。结论本例MHA患者缺乏常染色体显性遗传家族史，为“散发”病例；该患者MYH9基因40号外显子5797C→T突变为致病突变，而33号外显子4876A→G突变为一多态性。

非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHCⅡA)生理病理功能研究进展

非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHCⅡA)是Ⅱ型非肌肉肌球蛋白的主要亚型,近年来NMHCⅡA基因及蛋白功能的研究日益增多,引起国内外学者的广泛重视。已证实NMHCⅡA基因突变导致多种遗传性疾病,临床多见巨大血小板减少,并逐渐发展为伴有听力障碍、白内障和肾功能损伤;NMHCⅡA参与胞质分裂、细胞吞噬、细胞运动、血栓形成、炎症、肿瘤转移、视网膜变性、听力、肾脏功能调节等病理生理过程。MYH9不同位点的基因突变,NMHCⅡA蛋白构象的变化,表达量的改变,在细胞内分布的变化,磷酸化的强弱以及其结合蛋白的改变都可能成为影响肿瘤、心血官疾病发生发展的重要机制之一。本文就近年来NMHCⅡA主要生理病理功能做一综述。

儿童非肌性肌球蛋白重链9基因相关血小板减少性疾病诊断与治疗

非肌性肌球蛋白重链9基因相关疾病（nonmuscle myosin heavy chain 9 related disease，MYH9-RD）是MYH9基因突变引起的遗传性血小板减少性疾病，为常染色体显性遗传。患儿自出生起即表现为巨大血小板减少症，症状常伴随终生。通常表现为轻微出血症状，但因临床对该病认识不足，患儿常被漏诊或误诊为慢性免疫性血小板减少性紫癜（ITP），给予不必要甚至有害的治疗，造成不良预后。为避免这种情况发生，本文就儿童MYH9-RD诊断治疗进展做一阐述。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链B羧基端多肽单克隆抗体的制备及鉴定

为了得到能够特异性识别非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链B(NMHCⅡ-B)的单克隆抗体,根据Marc-145细胞上NMHCⅡ-B羧基端的蛋白质序列,合成多肽,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选阳性克隆;制备腹水并纯化;用间接ELISA和间接免疫荧光试验检测纯化抗体的特异性。结果显示,获得2株能稳定传代并分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系;单克隆抗体的特异性鉴定显示,2株细胞系所产生的抗体能够特异性地与NMHCⅡ-B羧基端蛋白反应而且能与Marc-145细胞产生特异性的结合。这2株单抗的制备及鉴定为研究易感细胞上NMHCⅡ-B与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的关系奠定了基础。

肌球蛋白ⅡB对人脐静脉血管内皮细胞中肿瘤坏死因子受体1转位影响的观察

目的:观察非肌肉肌球蛋白重链ⅡB(nonmuscle myosin heavy chainⅡB,NMHC-ⅡB)对人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中肿瘤坏死因子受体1(TNF receptor 1,TN-FR1)转位的影响。方法:将成功构建的重组pEGFP-N1/TNFR1载体通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染入HUVECs,筛选获得稳定克隆株。设计并合成NMHC-ⅡB的小分子干扰RNA(small interference RNA,si RNA),用脂质体LipofectamineTM2000转染进入该稳定克隆株,差速离心加蔗糖密度梯度离心收获细胞质膜,Western印迹法观察TNFα诱导前和诱导后细胞质膜上TNFR1蛋白含量的变化。结果:与空白对照组比较,转染NMHC-ⅡB si RNA组进入HUVECs,可以明显抑制细胞内NMHC-ⅡB mRNA的表达[(0.670 4±0.024 2)∶(0.454 0±0.041 1),P<0.01],也可以明显减少TNFα诱导前[(0.430 6±0.028 9)∶(0.324 8±0.016 7),P<0.01]和诱导后[(0.660 9±0.026 5)∶(0.492 2±0.021 7),P<0.01]细胞质膜TNFR 1的含量。在转染NMHC-ⅡB si RNA的细胞,TNFα的诱导仍然可以提高细胞质膜TNFR 1的含量,诱导前、后比较[(0.324 8±0.016 7)∶(0.492 2±0.021 7),P<0.01]。结论:NMHC-ⅡB可能在TNFR1从反式高尔基体到细胞质膜的转位或运输中起正向作用,但是可能并不是惟一的或决定性的因素。