激活Notch1信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响

目的探讨转染人Notchl受体胞内段（NIcD）质粒激活Notchl信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响及其可能机制。方法构建带免疫荧光的NICD质粒与对照质粒，细胞转染后荧光激发显微镜下观察转染效率，Real-timePcR检测靶基因Hesl表达水平变化；CCK．8法计算NICD质粒转染后胰腺癌细胞增殖的影响；caspase3试剂盒检测NICD转染后凋亡通路关键酶caspase3活性的变化。结果荧光激发显示NICD转染效率在60％～80％之间；NICD转染可促进靶基因Hesl表达，提示激活Notchl信号通路。NICD转染可显著促进胰腺癌细胞生长增殖；caspase3活性在NICD转染后明显下降，差异均具有统计学意义。结论应用NICD质粒转染激活Notchl信号通路活性可通过抑制凋亡而促进胰腺癌细胞生长增殖。

刺山柑总生物碱对系统性硬皮病模型小鼠Notch通路的影响

目的:研究刺山柑总生物碱对系统性硬皮病(SSc)模型小鼠Notch通路相关蛋白Notch2、Delta-like 3(DLL3)、Jagged1和Notch胞内段1(NICD1)的影响。方法:将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(青霉胺125 mg/kg)和刺山柑总生物碱低、中、高剂量组(225、450、900 mg/kg),每组16只。除空白对照组外,其余各组小鼠皮下注射博来霉素4周复制SSc模型,刺山柑总生物碱各剂量组小鼠外敷相应剂量的刺山柑总生物碱乳膏,阳性对照组小鼠灌胃相应剂量的青霉胺,空白对照组和模型组小鼠外敷不含药的乳膏基质,每天1次,连续给药8周。末次给药后4 h,取各组小鼠给药区皮肤,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)法检测皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA表达,酶联免疫吸附法测定皮肤组织中DLL3含量,免疫组化法检测皮肤组织中Jagged1蛋白表达。结果:与空白对照组比较,模型组小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1 mRNA及DLL3含量、Jagged1蛋白表达均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,刺山柑总生物碱中、高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中NICD1 mRNA、DLL3含量、Jagged1蛋白表达均显著降低,刺山柑总生物碱高剂量组和阳性对照组小鼠皮肤组织中Notch2 mRNA表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:刺山柑总生物碱可抑制SSc模型小鼠皮肤组织中Notch2、NICD1、DLL3及Jagged1的异常表达,对SSc模型小鼠Notch通路的过度激活有一定的抑制作用。

大鼠Notch1胞质段的克隆及其表达

Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官形成等许多重要过程 .为了获得重组的NICD ,以大鼠脑cDNA文库为模板 ,用PCR方法扩增出编码NICD的基因片段 ,克隆至谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX KG中 ,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达 .表达的融合蛋白GST NICD分子质量约为 12 0ku左右 ,以包涵体和可溶性两种形式存在 ,易于亲合层析纯化 .为制备抗体和进一步的功能研究奠定了基础 .

Notch-1/NICD信号在普罗布考保护大鼠急性脑缺血后再灌注损伤中的作用

目的：研究普罗布考对大鼠急性脑缺血再灌注损伤后大脑的保护作用及其与Notch-1/Notch胞内域（NICD）蛋白信号通路的关系。方法：SD大鼠随机分为假手术组、缺血组及普罗布考组。采用大脑中动脉闭塞（MCAO）法建立局灶性脑缺血再灌注模型，经普罗布考腹腔注射处理后，采用转角试验判断神经功能，2,3,5氯化三苯四氮唑（TTC）染色法测量脑梗死体积，干湿法测定脑组织含水量，免疫印迹检测Notch-1和NICD蛋白的表达，免疫酶联反应检测血清中炎症因子白介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。结果：普罗布考可改善急性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，减轻脑水肿；与缺血组相比，普罗布考治疗组Notch-1/NICD蛋白表达降低，IL-8和TNF-α分泌也相应减少。结论：普罗布考可激活Notch-1/NICD信号通路，进而调节IL-8和TNF-α的表达，发挥对急性脑缺血再灌注损伤脑的保护作用。

Notch1胞内结构域真核表达质粒构建及在H9c2心肌样细胞的表达和生物学功能

目的构建Notch l胞内结构域(N1ICD)真核表达质粒,确定能在H9c2心肌样细胞内表达,并发挥生物学效应,为后续Notch1信号通路的研究提供实验依据。方法设计并合成1对含有BamH I和EcoR I酶切位点的特异性引物,以小鼠cDNA文库为模板,经PCR扩增得到了1 122 bp的目的片段,定向克隆至pcDNA 3.1/myc-His质粒,构建pcDNA3.1/N1ICD-myc-His真核表达质粒。通过双酶切及基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,48 h后提总蛋白,Western-blotting检测myc和Hes1,确定N1ICD能在H9c2细胞表达,并启动下游基因表达。结果表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His双酶切及基因测序正确,N1ICD可在H9c2心肌样细胞内高效表达,具有Notch1生物学效应。结论真核表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His构建成功,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础。

主动脉瓣膜钙化中胰高血糖素样肽-1对Notch1-Sox9信号通路的调控作用

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及GLP-1受体(GLP-1R)下游信号通路对主动脉瓣膜间质细胞钙化的调控作用。方法:收集16例因主动脉瓣病变行置换术患者(瓣膜钙化组)和20例因其他原因行心脏移植但瓣膜正常患者(对照组)的主动脉瓣。苏木精-伊红染色(HE染色)和茜素红染色法检测瓣膜结构变化及钙化情况,免疫组织化学染色检测GLP-1R表达情况。培养原代小鼠瓣膜间质细胞,分为正常培养组、钙化培养组和钙化培养+GLP-1组,茜素红染色检测钙化情况,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Sox9 mRNA表达水平,Western blot检测GLP-1R、Sox9、Notch胞内结构域(NICD)的蛋白表达水平,免疫荧光法检测Sox9细胞定位及NICD入核情况。结果:与对照组比较,瓣膜钙化组人主动脉瓣组织茜素红染色显示阳性区增加,免疫组织化学染色显示GLP-1R表达水平下降。体外培养小鼠主动脉瓣膜间质原代细胞,与正常培养组比较,钙化培养组光镜下发现细胞出现形态改变,茜素红染色阳性区域增加,GLP-1R蛋白表达水平明显下降(P<0.05),NICD入核量减少,NICD蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。与钙化培养组比较,钙化培养+GLP-1组光镜下细胞形态基本正常,茜素红染色阳性区域减少,GLP-1R蛋白表达水平明显升高,Sox 9的mRNA及蛋白表达水平明显升高,NICD入核量增加,NICD蛋白表达水平明显升高(P均<0.05)。结论:GLP-1通过激活其受体GLP-1R调控主动脉瓣膜间质细胞中NICD入核,诱导Sox9表达升高,抑制主动脉瓣膜钙化。

稳定表达Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定

目的构建Notch1胞内结构域(N1ICD)稳定表达的肺腺癌A549细胞株。方法采用PCR方法扩增N1ICD基因,构建慢病毒重组质粒p HBLV-N1ICD-Zs Green-Puro(LV-N1ICD),采用PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助包装原件载体质粒,使用慢病毒空载质粒(LV-Zs Green-Puro)和LVN1ICD共转染293T细胞包装慢病毒,利用药物筛选法测定病毒滴度。将A549细胞分成A549-N1ICD组和A549-Zs Green-Puro组,分别加入LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro,取制备好的慢病毒感染A549细胞,加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,荧光显微镜观察转染效率,以带有绿色荧光的细胞初步视为稳定转染的细胞株。以A549细胞为对照组,进一步采用q PCR和Western blot方法分别检测N1ICD mRNA及蛋白表达。结果 PCR及基因测序结果表明pHBLV-N1ICD-Zs Green-Puro重组质粒构建成功。LV-N1ICD组病毒滴度为1×10~8TU/m L,LV-Zs Green-Puro组病毒滴度为1×108TU/m L。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察细胞形态无明显变化,A549-Zs Green-Puro组和A549-N1ICD组70%~80%的细胞带有绿色荧光。对照组、A549-Zs Green-Puro组、A549-N1ICD组的N1ICD mRNA相对表达量分别为1.59±0.11、1.09±0.10、70.81±6.39,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。三组N1ICD蛋白相对表达量分别为1.99±0.13、1.73±0.08、6.58±0.43,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。结论成功构建了稳定表达N1ICD的肺腺癌A549细胞株。

Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建

目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒;设计4对N1ICD-sh RNA寡核苷酸序列,以构建GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒,将p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA共转293T细胞,检测Flag的表达,筛选理想的GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒。将p GC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-sh RNA与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞,以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA,分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-sh RNA分别感染H9c2心肌细胞,利用CCK-8检测细胞活力。结果 p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功,与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞后,取上清浓缩,分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力,LV-N1ICDsh RNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA包装成功,具有Notch1信号通路生物学功能。

Notch家族4个蛋白质对人胰腺癌细胞HPAC中YY1和EGFR表达的影响

Notch信号通路是肿瘤形成过程中一种重要的信号通路,其中心分子为Notch受体.Notch受体为细胞膜上的单次跨膜蛋白,介导细胞间信号转导,哺乳动物细胞内包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的4个成员.Notch家族4个蛋白质在结构和功能上存在差异.前期研究显示,Notch1信号通路与转录因子YY1(YING-YANG 1)、表皮生长因子受体(EGFR)间存在调控作用.本研究在人胰腺癌细胞HPAC中,采用RNA干扰技术,分别降低细胞中Notch家族4个蛋白质的表达,检测YY1和EGFR在m RNA和蛋白质水平上的表达;并构建相应的激活形式的Notch受体——Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)真核表达质粒,在HPAC细胞中分别过表达4种NICD,检测其对YY1和EGFR表达水平的影响.结果显示,降低细胞中Notch1或Notch3的表达,均使HPAC细胞中EGFR m RNA和蛋白质水平升高(P<0.05),而降低Notch2和Notch4后,EGFR m RNA和蛋白质水平没有改变(P>0.05).分别降低4个Notch的表达,对YY1的蛋白质和m RNA表达水平均没有改变(P>0.05).在HPAC细胞中过表达N1ICD和N3ICD后,YY1和EGFR的蛋白质水平降低(P<0.05),而过表达N2ICD和N4ICD后,YY1和EGFR蛋白质水平没有改变(P>0.05).分别过表达4种NICD均没有改变YY1和EGFR的m RNA表达水平(P>0.05).初步得出结论是,在HPAC细胞中,Notch信号通路经Notch1和Notch3影响EGFR的表达.Notch1和Notch3对EGFR的表达可能具有负调控作用.在Notch1和Notch3过度激活时,这种调控作用通过YY1介导.本文可为深入研究Notch信号通路对胰腺癌发生发展的作用机制提供有意义的参考.

重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域(NICD1)外源性激活Notch信号通路

目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Westernblot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。

双氢青蒿素通过下调NICD-1抑制胶质瘤生长

目的探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinine,DHA)对人神经胶质瘤生长的影响及机制。方法人胶质瘤U251细胞株传代培养,设置空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、DAPT组和DHA(10、20、40、80μmol/L)实验组,应用CCK-8和FCM检测细胞增殖、周期及凋亡,Western blot检测Notch1的胞内区域(NICD-1)及其下游靶蛋白Hes1的表达水平。建立裸鼠皮下胶质瘤模型(n=20),按随机数字表法分为DMSO组、DAPT组、DHA(50、100 mg/kg)治疗组,每组5只,根据时间体积曲线计算各组抑瘤率,免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤组织中NICD-1表达水平变化。结果与空白对照组和DMSO组相比,实验组U251细胞增殖率显著下降,G1期细胞所占百分比显著上升,S期细胞所占百分比显著下降,早期凋亡率显著上升(P<0.05),NICD-1及Hes1蛋白表达水平显著低于空白对照组(P<0.05),均呈浓度依赖关系;DHA各治疗组的裸鼠皮下移植瘤生长速率及移植瘤组织内NICD-1表达显著低于DMSO对照组(P<0.05)。结论 DHA有效抑制人神经胶质瘤的生长,其作用机制可能与通过下调NICD-1表达抑制Notch信号通路有关。

上调NICD对人牙周膜干细胞增殖及迁移能力的影响

目的:研究上调Notch胞内区域(Notch Intracellular Domain,NICD)对人牙周膜干细胞增殖及迁移能力的影响。方法:将细胞分为上调组、对照组及空白组,使用MTT比色法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,采用细胞划痕实验检测细胞迁移情况,并使用Western blot检测人牙周膜干细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白(TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2)表达量。结果:对照组各时间点的人牙周膜干细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、迁移、黏附个数、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量均低于空白组,且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达量高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。上调组各时间点人牙周膜干细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、迁移、黏附个数、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量均高于空白组和对照组,且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达量均低于空白组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:上调NICD基因能促进人牙周膜干细胞的增殖和迁移,其机制可能与Wnt/β-catenin通路有关。

人源性Notch-1胞内段腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建携带人Notch-1胞内区基因的腺病毒载体(Ad-GFP-NICD),观察其在真核细胞中的表达。方法:通过PCR从pIRES2-EGFP-NICD质粒中扩增目的片段Notch-1胞内区,定向克隆至穿梭质粒载体pShuttle-CMV-EGFP中,经酶切及测序鉴定后,将Notch-1胞内区定向克隆至重组腺病毒骨架载体pAdxsi,构建携带人Notch-1胞内区基因表达盒及绿色荧光蛋白的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NICD)。酶切鉴定正确后,转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒的包装、生产及纯化,半数组织感染量法测定病毒滴度。用重组腺病毒转染人脐静脉内皮细胞,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达,并通过PCR扩增观察细胞Notch-1胞内区的表达。结果:成功构建了携带人Notch-1胞内区的重组腺病毒,纯化后病毒滴度达1.6×1010pfu/mL。腺病毒载体转染人脐静脉内皮细胞后24 h在荧光显微镜下即可观察到绿色荧光蛋白,48 h更为强烈,PCR扩增证实细胞表达Notch-1胞内区。结论:成功构建了携带Notch-1胞内区的重组腺病毒载体,为进一步研究Notch信号通路促进动脉形成的机制研究奠定了实验基础。

表达小鼠Notch1胞内段基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 Notch信号通路在进化中高度保守,在细胞的生长和分化方面起重要作用.构建小鼠Notch胞内段（NICD）慢病毒载体,为Notch信号通路的研究奠定了基础.方法 从C57BL/6J小鼠脊髓组织提取总RNA,逆转录合成cDNA,用PCR方法获取NICD的基因序列,构建慢病毒表达NICD载体,感染HEK293T细胞,实时定量PCR和Western blot分析NICD基因在靶细胞的表达.结果NICD基因在靶细胞的表达水平升高.结论 成功构建表达小鼠NICD基因的慢病毒载体,为今后相关实验研究奠定了基础.

超表达Notch胞内结构域对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

目的探讨超表达Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSC)增殖和成骨分化的影响,为牙周病骨缺损的治疗提供依据。方法以第3代稳定超表达NICD的hPDLSC为实验组,以正常hPDLSC为阴性对照组,转染空载体的hPDLSC为空白对照组,通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测超表达NICD对hPDLSC增殖能力的影响;通过茜素红染色和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测超表达NICD对hPDLSC成骨相关基因:牙骨质附着蛋白(cementum attachment proteins,CAP)、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,RUNX2),Notch信号通路受体Notch1的影响;通过蛋白质免疫印迹法检测超表达NICD对hPDLSC成骨蛋白RUNX2和flag标记蛋白(用以标记NICD)的影响。结果CCK-8结果显示,3组1~2d的A值相比差异均无统计学意义(P>0.05);实验组3~7d的细胞数量(A值分别为0.203±0.016、0.364±0.014、0.449±0.020、0.549±0.020及0.570±0.020)与其他两组相比显著增加(P<0.05)。茜素红染色结果示,与空白对照组及阴性对照组相比,实验组染色的矿化结节形成范围小颜色浅;qPCR结果显示,实验组14及21dCAP基因表达量(0.751±0.058、0.887±0.025)、骨钙蛋白基因表达量(0.592±0.051、0.670±0.045)及RUNX2基因表达量(0.319±0.038、0.684±0.055),均较阴性对照组及空白对照组显著降低(P<0.05),但14及21d的Notch1表达水平(2.507±0.047、4.041±0.219)显著高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)。蛋白质印迹法结果显示,实验组14及21dflag标记蛋白表达量(0.167±0.007、0.204±0.010)均显著高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05),但RUNX2的蛋白表达量(0.075±0.006、0.074±0.013)均显著低于阴性对照组(0.092±0.003、0.118±0.008)及空白对照组(0.174±0.006、0.212±0.008)(P<0.05)。结论超表达NICD可以促进hPDLSC的增殖能力,同时抑制其成骨分化。