草鱼E_3泛素连接酶Nrdp1基因cDNA克隆和表达分析

神经调节素受体降解蛋白1(neuregulin receptor degradation protein-1,Nrdpl)是一种新的E3泛素连接酶,可调节细胞增殖和凋亡等。研究采用RACE方法从草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝脏中克隆了Nrdpl的全长cDNA序列;采用半定量RT-PCR方法分析该基因在草鱼不同组织中表达情况。结果表明:该序列全长cDNA大小为1 865 bp(GenBank登录号:JX864048),其中开放阅读框为954 bp,编码318个氨基酸,预测分子量大小为36.09 ku,pH为7.0时理论等电点为5.83;5’和3’非翻译区的长度分别为291 bp和620 bp,在3’非翻译区发现2个mRNA不稳定信号(ATTTA)和1个多聚腺苷酸加尾信号(ATTAAA)。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,其二级结构主要以α-螺旋为主,不含β-折叠。氨基酸序列保守性分析表明,草鱼Nrdp1与斑马鱼、虹鳟及人的同源性分别为98%、94%和89%;该基因在心脏和脑中的表达量较多,在肌肉和血液中表达很少。

E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌诱导细胞凋亡的影响

为了探讨E3泛素连接酶Nrdp1、SOCS-1基因在布鲁氏菌侵染巨噬细胞过程中对细胞凋亡的影响,构建Nrdp1、SOCS-1基因的干扰和过表达细胞模型(简称为pLL3.7-N1、pLL3.7-S1和pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1);羊种布鲁氏菌16M(简称16M)侵染正常细胞RAW264.7及pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEX-SOCS-1组细胞,qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、TNF-α的mRNA表达量,并通过流式细胞仪术检测细胞凋亡率。结果显示,试验成功构建并筛选出干扰和过表达Nrdp1、SOCS-1效果最好的pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEXSOCS-1细胞模型;16M侵染各组细胞,与对照组相比,在不同的时间段pLL3.7-N1、pLL3.7-S1、pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞的Bcl-2和Bax的mRNA表达量差异显著(P<0.05);pLL3.7-S1组细胞的TNF-αmRNA显著降低(P<0.05),而pLEX-SOCS-1组显著升高(P<0.05);pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),而pLL3.7-S1组显著降低(P<0.05)。研究结果表明,Nrdp1、SOCS-1基因与16M诱导的细胞凋亡密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。

Nrdp1 siRNA重组腺病毒载体的构建及其对心肌肥大的影响

目的构建及鉴定神经调节素受体蛋白1(Nrdp1)基因siRNA重组腺病毒载体,初步研究Nrdp1基因对心肌细胞肥大的影响。方法设计并合成Nrdp1的siRNA靶向DNA序列,克隆至穿梭载体GV119中,并与腺病毒骨架质粒Ad Max在BJ5183细菌中进行同源重组,转染HEK293细胞,包装得到含si Nrdp1的重组腺病毒,实时定量PCR及Western blot检测重组腺病毒对新生大鼠原代心肌细胞Nrdp1表达的影响。然后利用血管紧张素Ⅱ和沉默Nrdp1的腺病毒干预体外培养的新生大鼠原代心肌细胞,实时定量PCR检测心肌肥大标志基因(ANF、β-MHC、Skeletal-α-actin)的表达。结果酶切后PCR分析、测序鉴定表明,干扰Nrdp1腺病毒构建成功,病毒纯化后滴度为1.5E+9 PFU/m L;重组干扰Nrdp1腺病毒可在蛋白水平和mRNA水平明显抑制Nrdp1的表达(P<0.001);沉默Nrdp1基因后,可明显上调血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大标志基因ANF、β-MHC和Skeletal-α-actin的表达(P<0.01)。结论构建的Nrdp1 siRNA重组腺病毒能有效地抑制新生大鼠原代心肌细胞中Nrdp1表达,且Nrdp1基因沉默后可加重AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

过表达miR-497通过靶向作用于神经调节蛋白受体降解蛋白1(Nrdp1)促进U87胶质瘤细胞的增殖

目的在U87人脑胶质瘤细胞中过表达miR-497,探讨miR-497对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法包装阴性对照(NC)及miR-497慢病毒;构建U87-NC及U87-miR-497细胞系;荧光素酶报告基因实验检测miR-497在U87细胞中与神经调节蛋白受体降解蛋白1(Nrdp1)的靶向关系;集落形成实验检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞周期变化;Western blot法检测Nrdp1、AKT及磷酸化的AKT(p-AKT)蛋白表达水平。结果成功包装p GLV3/H1-NC及p GLV3/H1-miR-497慢病毒;构建稳定的U87-NC及U87-miR-497细胞系;过表达miR-497的U87-miR-497细胞较对照组U87-NC细胞集落形成能力增强;荧光素酶报告基因实验证实miR-497在U87细胞中靶向作用于Nrdp1;在稳定感染细胞中,过表达miR-497后Nrdp1蛋白水平降低,p-AKT蛋白水平增加,而AKT蛋白未见明显改变。结论过表达miR-497通过靶向作用于Nrdp1促进U87胶质瘤细胞的增殖。