淋球菌外膜蛋白NspA基因重组子的构建与表达

目的构建淋球菌标准株外膜蛋白NspA基因重组子,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达外膜蛋白NspA。方法提取淋球菌标准株基因组DNA,PCR扩增其NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c(+)中,构建pET-NspA重组子,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和WesternBlot检测表达蛋白。结果成功构建了淋球菌标准株的pET-NspA大肠杆菌表达重组子,经IPTG诱导表达后,该蛋白在大肠杆菌中高效表达。结论淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中的成功表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防淋病的疫苗奠定了基础。

淋病奈瑟菌标准株外膜蛋白NspA基因重组质粒构建和生物信息分析

[目的]研究淋病奈瑟菌标准株(NG 29403和NG 29400)外膜蛋白NspA基因和NspA融合蛋白结构特点,为淋病奈瑟菌疫苗靶蛋白的选择提供依据。[方法]PCR扩增淋病奈瑟菌标准株NG 29400和NG 29403 NspA基因,与表达质粒pET-30c(g+)构建重组子NspA-pET-30c(+),阳性克隆子经双酶切鉴定后进行基因测序。以生物软件对NspA基因进行生物信息分析,并在线预测其蛋白质结构。[结果]成功构建NspA-pET-30c(+)重组质粒,双酶切获得0.5kb和5.4kb预期产物。基因序列分析表明淋病奈瑟菌NspA基因有较高同源性,两标准株与GenBank已有序列均有98%同源性,且与脑膜炎奈瑟菌NspA基因高度近似。蛋白预测显示NspA融合蛋白有40%以上为环状结构,可能为主要功能区。三级结构与脑膜炎奈瑟菌NspA相似。[结论]淋病奈瑟菌NspA基因具有高度保守性,与脑膜炎奈瑟菌NspA基因同源性高,蛋白结构相似,有望成为淋病奈瑟菌疫苗的候选抗原。

奈瑟氏淋球菌表面蛋白A基因克隆及在真核细胞中的表达研究

为了研制奈瑟氏淋球菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(NeisseriasurfaceProteinA ,NspA)的核酸疫苗 ,根据淋球菌NspA的基因序列 ,设计一对寡核苷酸引物。以淋球菌WHO A菌株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得具有完整开放读码框架 (ORF)的NspA基因 ,并将其正向插入真核表达载体pCMVscript,成功构建了表达NspA基因的真核细胞表达载体pcNspA。用脂质体包裹pcNspA重组质粒转染COS细胞 ,以间接免疫荧光分析法分析NspA基因的表达 ,发现转染pcNspA的COS细胞能高表达NspA抗原。淋球菌免疫保护性抗原NspA基因的克隆与真核细胞表达 。

脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A的克隆表达及血清学分析

目的构建并表达功能性的脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A(NspA)的重组蛋白,并检测流行性脑脊髓膜炎(流脑)恢复期患者血清中的抗NspA抗体水平,探讨NspA作为新的流脑抗原疫苗的意义。方法从流脑患者流行株中克隆NspA基因构建原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,GSTrap FF亲和层析纯化出具有生物活性的NspA融合蛋白。采用纯化得到的NspA融合蛋白检测流脑恢复期患者血清中的抗NspA抗体。结果成功表达了功能性NspA蛋白,相对分子质量(Mr)为44 000。并用NspA融合蛋白检测到患者恢复期血清中存在有抗NspA抗体,且滴度为1∶40时,阳性率为90%。结论成功表达了NspA重组蛋白,并检测到自然感染流脑患者恢复期血清中的NspA抗体。