烟草NtPLR1基因克隆与表达分析

维生素B_6(VB_6)在植物体内参与多种生化反应,对植物生长至关重要,吡哆醛还原酶(PLR)是VB_6代谢转换的作用酶,催化吡哆醛(PL)生成吡哆醇(PN),对维持细胞内VB_6的动态平衡发挥重要作用,而PLR在植物中鲜有报道。以拟南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛还原酶氨基酸序列At PLR1为模板,在公用数据库通过同源比对获得数条烟草Nicotiana tabacum Nt PLR1基因的片段,结合互补脱氧核糖核酸(c DNA)的末端快速扩增-聚合酶链式反应(RACE-PCR)技术获得了烟草吡哆醛还原酶Nt PLR1基因。该基因全长1 370 bp,编码369个氨基酸残基,预测其编码蛋白的分子量为41 kDa,理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果表明:Nt PLR1与其他物种的PLR1相似性较高。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析结果表明:外源吡哆醛PL处理时,Nt PLR1表达先升高后降低,在4 d达到顶峰。相应地,高效液相色谱分析结果表明:烟草叶片中PL含量随时间逐渐降低而吡哆醇PN含量逐渐升高,表明Nt PLR1可像酵母PLR一样,催化PL形成PN。此外,定量分析结果表明:Nt PLR1在烟草根、茎和叶片中均有表达,其中在叶片中表达显著高于其他部位(P<0.05)。在紫外线、氧化和盐害胁迫下,Nt PLR1的表达与对照相比均显著上调(P<0.05),表明Nt PLR1对这3种逆境有响应,可能参与烟草的抗逆过程。将Nt PLR1连入原核表达载体p ET32a,并进行诱导表达,成功表达出目的蛋白。报道的烟草Nt PLR1基因功能为进一步探明植物PLR基因的功能和调控机制以及VB_6的生物合成提供了重要参考。