A brief review of novel nucleic acid test biosensors and their application prospects for salmonids viral diseases detection

Viral diseases represent one of the major threats for salmonids aquaculture.Early detection and identification of viral pathogens is the main prerequisite prior to undertaking effective prevention and control measures.Rapid,sensitive,efficient and portable detection method is highly essential for fish viral diseases detection.Biosensor strategies are highly prevalent and fulfill the expanding demands of on-site detection with fast response,cost-effectiveness,high sensitivity,and selectivity.With the development of material science,the nucleic acid biosensors fabricated by semiconductor have shown great potential in rapid and early detection or screening for diseases at salmonids fisheries.This paper reviews the current detection development of salmonids viral diseases.The present limitations and challenges of salmonids virus diseases surveillance and early detection are presented.Novel nucleic acid semiconductor biosensors are briefly reviewed.The perspective and potential application of biosensors in the on-site detection of salmonids diseases are discussed.

2016至2020年杭州地区无偿献血人群HIV感染状况分析

目的了解杭州地区无偿献血人群HIV感染状况,为本地区降低HIV经输血传播风险,制定有效献血者招募及艾滋病防控策略提供数据支持。方法采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和病原体核酸检测技术(nucleic acid testing,NAT)对2016年1月至2020年12月杭州地区902847例无偿献血者标本进行抗HIV-Ⅰ/Ⅱ抗体/抗原和HIVRNA检测。抗-HIV抗体/抗原或HIVRNA反应性标本送杭州市疾病控制中心进一步采用Western blot法和NAT进行确认。结果2016年1月至2020年12月杭州地区共检测HIV确证阳性103例,阳性检出率为0.01%,其中101例ELISA和NAT筛查均为阳性反应,2例ELISA筛查为阴性反应,NAT为阳性反应。103例感染者中,以男性(91.26%,94/103)、18~35岁(69.90%,72/103)、初次献血者(68.93%,71/103)为主。2016至2020年献血者HIV阳性率呈逐年下降趋势(χ^(2)=7.181,P=0.007)。男女献血者HIV阳性率各年的差异无统计学意义(χ^(2)=10.336,P=0.350;χ^(2)=0.653,P=0.957)。各年龄组献血者HIV阳性率各年的差异无统计学意义(χ^(2)=6.378,P=0.173;χ^(2)=2.318,P=0.678;χ^(2)=5.284,P=0.259;χ^(2)=9.183,P=0.057)。结论近5年HIV感染在杭州市无偿献血人群中呈低流行水平,但仍存在感染风险,应加强在低危人群中招募献血者并且应采用先进的检测技术,选择合适的检测策略,保证血液安全。

HBV、HCV、HIV血筛多中心研究免疫学灰区的核酸检测分析与临床特征研究

目的分析化学发光灰区标本的临床特征及核酸检测对化学发光灰区标本结果判断的指导性意义。方法收集2021年7月—12月全国不同地区的5家综合医院入院患者术前/输血前血源性传播疾病样本检测结果,对化学发光灰区检测结果的标本进行核酸检测结果及临床特征分析。结果5723例样本中总计检出HBV免疫灰区样本28例(占比0.49%),HCV灰区样本20例(占比0.35%)。经核酸检测验证,28例HBV灰区样本中,15例HBV样本核酸检测为阳性(占比53.5%),其HBcAb也均为阳性;13例HBV样本核酸检测为阴性(占比46.5%),其中HBcAb阳性4例。HBV与HCV免疫检测灰区在临床各个科室均有发现,出现HBV灰区样本最多的前三科室为骨科、妇科、泌尿科,灰区样本核酸验证假阳性最多的临床科室为妇科与骨科。HCV灰区样本最多的前三科室为泌尿、肾内、外科,且均为假阳性。HBV灰区样本患者临床诊断结果有35.7%(10/28)为肿瘤类疾病,HCV灰区样本患者临床诊断结果有40%(8/20)为肿瘤类疾病。结论化学发光法容易造成假阳性结果,应注意复检验证,且设置灰区并非必要。灰区样本可见于多个临床科室,具有一定的临床分布特征。核酸检测可以提高检测灵敏度并且更大限度保证结果的准确性,能够验证免疫检测灰区。

核酸单反应性质量控制多规则的建立

目的探讨建立1个基于Poisson分布的监控核酸筛查实验室污染情况的质控机制。方法收集2022—2023年基立福Panther核酸检测系统的核酸单反应性率和鉴别试验反应性率相关数据,采用Poisson分布概率法计算每日核酸检测单反应性的概率,利用单反应性率和鉴别反应性率及ROC曲线分析法进一步验证该质控模型的灵敏度和特异性,并提出相应的多规则化的质控策略。结果仅以P=0.05为失控限,Poisson分布概率质控模型判定P<0.05的失控点为40个,结合鉴别反应性率进行人工验证后发现失控点为20个,其判定失控的灵敏度为60.0%,特异性为95.6%,失控点较多,结合鉴别反应性率和运用多规则化质控方法进行质量监控后,2022—2023年核酸检测单反应性警告点为18个,失控点为2个。结论基于Poisson分布概率的多规则核酸单反应性监控机制,更适用于核酸实验室监测预警实验室污染,有利于提升核酸实验室管理能力和检测质量。

海南地区输血传播疾病病毒核酸检测窗口期残余风险评估

目的分析11年来海南地区无偿献血人群核酸检测(NAT)结果、评估HBV、HCV和HIV的NAT检测后残余风险。方法收集本中心2012年1月-2022年12月的无偿献血者NAT检测结果数据,利用新发感染率-窗口期残余风险模型对献血者进行HBV、HCV和HIV窗口期残余风险评估。结果2012年1月-2022年12月,海南地区无偿献血者捐献的血液中,来自初次献血者的占比45.02%(522684/1161042)、重复献血者(含固定献血者)占54.98%(638358/1161042),固定献血者占30.48%(354227/1162042);NAT总阳性率为0.19%(2151/1161042);NAT检测后HBV窗口期残余风险为62.54/百万,HCV残余风险为0.431/百万,HIV残余风险为0.791/百万。结论海南地区无偿献血者开展NAT检测明显降低HCV残余风险,输血传播HBV、HCV、HIV的窗口期残余风险处于较低的水平。

追踪隔离措施与核酸检测力度对南京新型冠状病毒肺炎疫情影响的分析与评估

2021年7月,南京市爆发由德尔塔变异毒株引起的新型冠状病毒肺炎疫情(COVID-19)。依据南京市卫生健康委员会公布的实际数据,建立符合疫情发展的时间依赖COVID-19传播动力学模型,将实时数据应用于模型参数估计和有效再生数计算,分析和评估了此次疫情采取的隔离防控措施和核酸检测强度。结论表明:隔离力度和核酸检测强度对疫情防控有重要影响。该研究结果在一定程度上促进了新型冠状病毒肺炎传播动力学建模与分析工作的研究,对未来应对突发性传染病有一定借鉴意义。

核酸检测与抗体测定对儿童肺炎支原体感染的诊断价值

目的探究肺炎支原体核酸检测(MP-DNA、MP-RNA)与肺炎支原体抗体测定(MP-IgM)对儿童肺炎支原体感染的诊断价值。方法收集2023年11月至2024年2月医院收治的201例呼吸道疾病患儿的外周血标本和咽拭子,分别采用荧光核酸恒温扩增检测技术检测MP-RNA、取-70℃冻存后咽拭子标本,采用实时荧光定量PCR方法检测MPDNA、采用胶体金免疫层析法检测MP-IgM,将MP-DNA、MP-IgM与金标准(MP-RNA)进行比较,统计检测结果的一致性。结果MP-DNA灵敏度为89.47%,特异度为97.55%,与MPRNA检测结果一致性极好(Kappa=0.87)。MP-IgM灵敏度为34.21%,特异度为93.87%,与MP-RNA检测结果一致性较差(Kappa=0.33)。结论MP-DNA与MP-IgM相比,在肺炎支原体的诊断中具有更高的应用价值,特别是感染初期。对于满足门、急诊对实验室报告及时、高效的需求,可考虑抗体测定与核酸检测法相结合,提高实验室对肺炎支原体的诊断能力。

人类免疫缺陷病毒抗体初筛阳性确证结果分析及化学发光法检测抗体吸光度值/临界值灰区范围的合理性探究

目的分析人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体初筛阳性确证结果及化学发光法检测抗体吸光度值/临界值(S/CO值)灰区范围的合理性。方法收集184例HIV抗体筛查阳性标本。采用免疫印迹法(WB)及病毒核酸测定法进行确证,观察确证结果及条带分布。采用受试者工作特征(ROC)曲线预测最佳临界值,分析HIV抗体S/CO值灰区设置的合理性。结果184例HIV抗体筛查阳性标本中,经化学发光法初筛153例(83.15%),经胶体金法初筛31例(16.85%)。男性(57.07%)、年龄在40岁以上(75.00%)的HIV抗体初筛阳性病例占比高于女性及其他年龄段病例。WB补充试验发现,共101例(54.89%)病例确证为HIV-1抗体阳性,56例(30.43%)病例确证为HIV-1抗体阴性,27例(14.67%)病例为HIV-1抗体不确定。27例中,1例经核酸检测为阳性(化学发光法初筛抗体S/CO值:5.60),其余26例为阴性。化学发光法、胶体金法与WB补充试验的阳性符合率分别为65.36%、3.23%,差异有统计学意义(χ^(2)=40.191,P<0.05)。27例HIV-1抗体不确定病例经核酸检测载量发现,1例病例WB带型为P24+gp160,核酸检测该病例为阳性。不确定样本带型分布中,P24出现率最高(74.07%),其后依次是P66(11.11%)、gp160(7.41%)和P17(3.70%)、gp41(3.70%)。ROC曲线预测HIV抗体S/CO最佳临界值为5.15,曲线下面积(AUC)为0.904,敏感度与特异度分别为83.30%、76.40%,95%CI为0.861~0.948。HIV抗体初筛阳性病例的WB检测带型与确证结果之间具有较好相关性(P<0.05),其中P24带型与确证结果之间的相关性最高(r=0.910)。结论HIV抗体初筛阳性病例中存在一定的假阳性,采用WB实验能进行有效排查。此外,基于本实验检测平台设置化学发光法检测HIV抗体S/CO值灰区范围为1.00~5.15,其具有较高的敏感度。

基于HBV感染的确认探讨核酸检测反应性献血者的归队策略

目的基于血液筛查核酸检测反应性献血者的HBV感染的确认,探讨核酸检测反应性献血者的归队策略。方法联合应用自建的高灵敏度核酸检测体系、血液核酸筛查等多种核酸检测(NAT)方法,并结合血清学检测、献血者随访,对核酸检测反应性(NAT-yield)献血者中的HBV感染进行确认和感染状态识别。依据确认的HBV感染血浆样本,比较不同确认方法、确认指标或指标组合对HBV感染确认的效果。结果2010年11月—2021年2月,在血液筛查检出的876位NAT-yield献血者中共确认HBV感染者511人(OBI 451人,急性早期HBV感染者27人,不能确认感染者33人,无感染者30人,不能确认HBV感染者335人)。采用单检系统对混检系统检出的HBV感染血浆进行复测的检出率为96.6%,明显高于混检系统对单检系统检出的HBV DNA反应性(HBV DNA R)组和鉴别试验无反应性(NDR)组的复测检出率(76.4%和55.7%)(P<0.05)。NDR样本在模式2(ID×5+鉴别×2)下复测检出率(65.2%)高于模式1(ID×2+鉴别×1)(39.2%)(P<0.05);2种单检复测模式下的HBV DNA R样本复测检出率无明显差异(P>0.05),但均明显高于NDR样本(P<0.05)。回溯OBI献血者既往NAT数据,有46%经历多次NAT检测而未能检出。有59.1%OBI献血者随访检不出HBV DNA。OBI献血者中抗-HBc+占比为90.2%,单独抗-HBc+为49.2%,远高于不能确认感染组(P<0.05);HBeAg、抗-HBe和抗-HBc IgM在OBI和不能确认感染组中的比例极低且无差异(P>0.05)。结论近60%的NAT-yield献血者可以确认HBV感染。为保证献血者归队的安全性,需要更高灵敏度的HBV DNA确证技术提高HBV感染的确认率。抗-HBc是NAT-yield献血者OBI风险排查和归队评估最重要的血清学指标。

2018—2023年新疆乌鲁木齐市主城区鸽新城疫流行情况实验室调查

为了解主城区近年鸽散养户新城疫的免疫情况和养殖环境中的流行情况,2018—2023年分别采集4个主城区25个散养户的鸽血清样本1972份、鸽舍环境棉拭子150份、鸽双腔棉拭子750份,通过血凝及血凝抑制试验和荧光定量PCR的方法,进行新城疫抗体水平监测和新城疫病毒核酸检测。结果表明,乌鲁木齐市4个主城区免疫合格率呈逐年上升的趋势,仅2022年鸽新城疫免疫抗体均低于农业农村部规定的70%,其它均高于该标准;4个主城区中环境棉拭子新城疫病毒核酸群体阳性率2018—2023年分别为28%、20%、16%、28%、36%和20%;鸽双腔棉拭子新城疫病毒核酸个体阳性率2018—2023年分别为12.8%、11.2%、8.8%、8%、9.6%和4%。

核酸检测实验室质量管理探讨

为建立科学、规范的重大传染病核酸检测实验室质量管理体系,本文从组织管理、体系文件、实验室布局、环境、人员、仪器设备、检测操作过程以及生物安全防护等9个方面,系统分析总结了核酸检测实验室质量管理要点和关键控制要素,分享交流了行之有效的控制手段和科学的质控措施,以期为疾病预防控制或医疗机构核酸检测实验室的初建和管理体系有效运行提供借鉴和参考。

基于危害分析及关键控制点体系的核酸检测实验室质量控制研究

目的通过危害分析及关键控制点(hazard analysis and critical control point,HACCP)体系系统化控制核酸检测实验室质量,以期能够实现核酸检测实验室质量的提升,为有效制定核酸检测质量控制对策提供借鉴。方法根据HACCP体系初步探究核酸检测实验室质量控制,重点分析HACCP体系在核酸标本接收、准备试剂、提取标本核酸、核酸扩增、结果判读、核酸检测结果报告环节制定的监控程序、验证措施以及纠偏措施等重要控制点。结果通过分析2021年12月-2022年12月的检测数据,结果显示,各批次核酸检测阳性质控品均满足判定规则,每一批次的实验均处于在控状态。对HACCP体系下实验室数据进行统计,计算其标准差、均值以及变异系数,对箱型图绘制后,展开离群值检验,结果发现,均值没有产生离群值。结论核酸检测实验室中应用HACCP体系,能够有效控制核酸检测实验室质量,全面掌控核酸检测实验室重要控制点,实现实验室生物安全水平与质量的提升,保证核酸检测实验室质控的有效性与科学性,继而有效控制核酸检测实验室质量。

血液核酸筛查系统在不同检测筛查模式下的乙肝检测结果分析及评价

目的通过分析罗氏Cobas s 201的血液核酸检测(NAT)结果评估其对HBV的检测效果。方法将检测结果根据酶联免疫吸附试验(ELISA)和NAT混合检测(MP)、NAT单样本检测(ID)以及重复NAT单样本检测(rID)分组,分为ELISA+/NAT(ID)+、ELISA+/NAT(rID)+、ELISA-/NAT(ID)+、ELISA-/NAT(rID)+4组进行统计分析,探讨重复NAT对反应性结果的检出是否存在差异,对于不同ELISA结果的NAT反应性标本的循环阈值(cycle threshold,Ct)与核酸检出率的关联性。再通过补充试验,包括其他方法学的NAT系统和化学发光血清学标志物检测,进一步分析献血者的真实感染情况。结果766293份献血者标本中共有1691组HBV NAT(MP)+,其中1418组(83.86%)检出反应性结果(1418份HBV NAT+,7090份NAT-),仍有273组(16.14%)经重复检测仍未检出[共计1638份NAT-,Ct(MP):39.49±3.62]。HBV NAT+中,881份(62.13%)ELISA+/NAT(ID)+,19份(1.34%)ELISA+/NAT(rID)+,451份(31.81%)ELISA-/NAT(ID)+,67份(4.72%)ELISA-/NAT(rID)+。对于不同ELISA结果的标本,重复NAT对HBV的检出存在差异(P<0.05)。各组间Ct(ID)值仅ELISA+/NAT(rID)+和ELISA-/NAT(ID)+、ELISA+/NAT(rID)+和ELISA-/NAT(rID)+2组比较无差异(P>0.05),其余各组间两两比较,均有差异(P<0.05)。对228份ELISA-/NAT(MP)+(ID)-进行补充试验,有56份(24.56%)经化学发光检测HBsAg+和7份(3.07%)经其他NAT系统检出反应性。剩余221份(96.93%)NAT-标本中,53份(23.98%)HBsAg+的献血者可能存在慢性感染,40份(18.10%)抗-HBe+和(或)抗-HBc+的献血者可能存在既往感染,其余128份(57.92%)均无反应性的献血者为NAT(MP)假反应性,且各组间抗-HBs含量差异较大(P<0.05)。结论重复NAT对不同反应性类别或不同血清学结果的献血者标本存在差异性检出,尤其在一定区间范围内,对于ELISA-标本进行重复NAT可明显提高检出率。Ct值可辅助评估NAT系统的稳定性和准确性。对于ELISA-/NAT(MP)+(ID)-献血者,结合其他高灵敏度的检测手段可降低病毒残余风险,保障临床用血安全。

微流控芯片环介导等温扩增技术检测3种猪圆环病毒

为建立快速区分3种猪圆环病毒(PCV2、PCV3和PCV4)的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示:微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数(CV)均在2%以下,稳定性好。结果表明:3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。

江西省吉安市莱姆病疑似病例调查研究

目的了解江西省吉安市莱姆病疑似病例中确诊病例情况及其临床表现特征和地区来源分布,为莱姆病及时诊治提供依据。方法2021年12月至2022年8月从吉安市中心人民医院收集了133份莱姆病疑似病例血清,采用国际上通用的“两步法”进行莱姆病抗体检测,并采用巢式PCR方法检测血清中莱姆病螺旋体的基因,阳性标本进一步测序分析。结果133份莱姆病疑似病例血清中有25份伯氏疏螺旋体检测阳性,总阳性率为18.80%。其中,20份样本抗体检测阳性,阳性率为15.04%;6份样本核酸检测阳性,阳性率为4.51%。6例核酸检测阳性的患者的5S-23S rRNA基因间隔区的序列均与扬子疏螺旋体(Borrelia yangtzensis)的相应序列一致,并且其中1份样本抗体检测也为阳性。25例阳性患者来自吉安市的9个县区,其中吉州区的患者最多,占44%。阳性患者出现莱姆病相关症状,包括关节病变、神经疾病、感染性发热、皮炎或胸痛,其中关节病变的病人最多,占72%。6例扬子疏螺旋体感染者来自吉州区,其中4例表现为关节病变,2例表现为感染性发热。结论本次研究首次证实江西省吉安市存在莱姆病患者,并首次在我国南方的病人体内检测出扬子疏螺旋体。研究提示该地区医务人员在接诊具有关节炎、神经系统等症状的病例时,应考虑患者可能罹患莱姆病。研究表明吉安市存在莱姆病自然疫源地,应进一步开展莱姆病的调查和监测。

石家庄地区2012-2014年献血人群NAT检测情况分析

目的为进一步提高血液安全性,降低输血感染风险,分析在石家庄地区献血者中开展血液传染病毒核酸检测(NAT)的必要性和可行性。方法应用浩源核酸检测系统,对经ALT及两遍HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV、梅毒螺旋体ELISA检测结果均呈非反应性的287 728份标本,进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA-3项联合NAT筛查,初筛采用8人份混样法,对检出某项有反应性的混样池进行单人份拆分检测。结果 ELISA检测非反应性的287728份标本,共检测42 472个混样池,检出209个HBV DNA反应性混样池,混样池阳性率为4.92‰;拆分结果为84例HBV DNA阳性,检测阳性率为0.29‰,所有标本中无HCV RNA和HIV-1 RNA的检出。结论核酸检测可缩短血液病毒的检测"窗口期"并有效降低隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)的发生几率,进一步提高血液安全性。

TP53-R273H/R273C基因突变数字PCR检测方法研究

TP53基因是肿瘤的抑制基因,也是癌症中常用的靶向检测基因。R273H和R273C是TP53基因检测中常见的热点突变。为了建立这2个突变的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,针对突变位点分别设计了2套ddPCR方法,验证了探针的特异性,并对退火温度和引物探针浓度进行了优化。结果显示,所建立的方法具有良好的特异性和重复性,ddPCR法与重量法之间的相关系数为0.9997和0.9996。R273H和R273C的检出限均为0.02%,定量限均为0.05%。这2套方法可用于准确检测TP53-R273H和TP53-R273C基因突变,为临床应用提供支持。

科研项目成果在通识课程中的教学实践与探索

以“众里寻他千百度——核酸检测的应用”实验项目为例,探索将科研项目的部分内容应用于高校生物类通识课程的实践经验。该项目以拟南芥T-DNA插入突变体为材料,通过基因组DNA的提取、PCR检测和条带分析等,探讨核酸检测技术在科学研究和医学检验中的应用,涵盖一个完整的富含生物学特色的科研过程。该项目在通识课程中的实践,使非生物专业的学生在获得生物学核酸提取相关知识点和实验技能点的同时,了解生物学科研项目的实施过程;同时,通过鼓励学生思考核酸检测技术手段发展的背景、过程和意义,培养学生的发散性思维和创新实践能力,为培养新时代全面创新型人才奠定基础。