狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。

汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的从国内生产肾综合征出血热(HFRS)疫苗Z10株中克隆汉坦病毒核蛋白基因,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达,制成抗原片,用于检测血清中汉坦病毒抗体。方法从汉坦病毒Z10株感染细胞上清液中提取病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增S基因,与穿梭质粒连接并转化大肠杆菌,得到重组穿梭质粒。将其转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌,筛选出含S基因的重组杆状病毒DNA的大肠杆菌,提取重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞,应用ELISA法及间接免疫荧光法检测重组蛋白的抗原性。结果用RT-PCR方法扩增得到S基因,筛选出的重组杆状病毒感染细胞sf9,制成抗原片。此抗原片仅与HFRS阳性患者血清起反应,而与正常人及其它发热患者血清不起反应。检测浙江省各医院送检的97份疑似肾综合征出血热患者血清及36份正常人血清,与传统的抗原片比较,阳性符合率为100%。结论可以应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达汉坦病毒重组蛋白。以此制备的抗原片,可用于患者血清中汉坦病毒抗体检测,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,为诊断肾综合征出血热提供新的途径和手段。