靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

[目的]研究靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定。[方法]设计并人工合成靶向PRRSV核蛋白N基因的3个siRNA靶序列,将其插入CMV启动子下游,克隆到真核表达载体pSilencer4.1-CMV中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。[结果]成功构建了靶向核蛋白基因表达的siRNA干扰重组质粒载体pSilencer-N。[结论]该研究为进一步运用RNA干扰技术进行PRRSV防治研究奠定了基础。

狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。

重组汉坦病毒核衣壳蛋白抗原用于胶体金标记免疫层析法检测肾综合征出血热抗体

目的 制备高表达量、高活性的HVNP重组抗原，以此为基础建立一个可同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体的快速胶体金标记诊断试剂盒。方法 从TA-A537中扩增出截短的HV S基因片段p6-119，定向克隆至原核表达载体pET-30a中进行原核表达，采用亲和层析法纯化重组蛋白。以胶体金标记重组抗原，应用金标快速免疫层析法同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体。结果 金标快速免疫层析法可同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体，与WA比较，IgG抗体检测的敏感性和特异性分别为94．9％、100％。与ELISA比较，IgM抗体检测的敏感性和特异性均为100％。结论 截短的重组汉坦病毒NP蛋白表达量高且具有良好的抗原性。以此为基础建立的金标快速免疫层析法显示出很高的敏感性和特异性，且具有简便、快速等优点，非常适用于各种层次尤其是缺乏实验条件和专业人员的基层医疗单位对HFRS疑似患者作出早期诊断。

早期快速诊断肾综合征出血热胶体金试纸条的研制

目的建立一种可早期、快速检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清中抗汉坦病毒IgM抗体的胶体金试纸条方法。方法用胶体金标记纯化的汉坦病毒重组核蛋白（rNP），将羊抗人μ链抗体固定于硝酸纤维素膜上作为检测区，以鼠抗汉坦病毒抗体作为质控区，组装成免疫层析试纸条检测HFRS确诊患者以及健康人血清，并与ELISA对照，评价其特异度和敏感度。结果在试纸条加入待检血清后10～15min内即可获得结果，经临床ELISA确诊的50份HFRS患者血清均呈阳性，健康人血清标本均为阴性。结论该胶体金免疫层析快检纸条与ELISA法的检测结果具有很高符合率，可用于HFRS患者的早期诊断，该法操作简便、反应迅速、无需特殊仪器设备，适于在基层医疗单位推广使用。