人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b(+)上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b(+)-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca^(2+)、K^(+)、Na^(+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)都对酶有激活作用,且Mg^(2+)效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。

风疹病毒E1蛋白原核可溶性表达、纯化及血清学诊断研究

目的通过基因工程的方法获得风疹病毒E1蛋白在原核系统内可溶性表达，亲和纯化后，评价该重组蛋白在风疹病毒患者血清学诊断方面的可行性。方法将PCR扩增得到的风疹病毒E1核酸序列克隆至原核表达载体pET-NusA中，利用原核系统表达融合蛋白NUSA-E1，用WesternBlot和ELISA方法对其抗原性进行初步评价。结果NUSA-E1蛋白以可溶性形式进行表达，亲和纯化后可以获得高纯度的重组蛋白。WesternBlot和EI。ISA方法结果均证明该重组蛋白具有较强的抗原活性。结论融合蛋白NusA-E1在大肠埃希菌中以可溶性形式表达，高纯度的重组融合蛋白NUSA—E1抗原性强，临床上可以作为血清学诊断抗原，检测风疹病毒抗体。

重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中融合可溶表达

将N-利用基质(NusA)和人骨形态发生蛋白-2成熟肽(hBMP-2m)的编码基因进行基因融合,实现了hBMP-2m在大肠杆菌中的融合可溶表达.以大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增得到NusA基因,通过NdeⅠ和AflⅡ酶切位点将其置换出重组融合表达载体pDsbA-hBMP-2m中的DsbA基因,使hBMP-2m基因重组于NusA基因的下游,重组质粒转化E.coli BL21(DE3),获得工程菌.在30℃条件下,经IPTG诱导表达后,融合蛋白占细胞总蛋白的45%左右,并且主要以可溶形式存在,可溶部分达90%以上.经过简单的Ni 2+柱一步纯化即可得到纯度较高的融合蛋白.通过融合表达的方式表达出可溶性的目的蛋白,有望复性后通过肠激酶酶切得到hBMP-2m单体,进一步二聚体化得到具有生物活性的hBMP-2m.

重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达

目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原.

hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

将人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(hTNFR1)基因克隆到p ET-22b表达载体,成功构建了重组表达质粒pETH1,电转到Escherichia coli BL21(DE3)表达菌株中进行摇瓶发酵。实现了hTNFR1在大肠杆菌表达系统中的重组表达。但目的蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高hTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达,融合标签和分子伴侣两种策略被实施用于辅助hTNFR1的可溶性表达。结果表明,在hTNFR1的N端融合Nus A标签后,hTNFR1的可溶性有一定提高;在Nus A-hTNFR1基础上,过表达了7种分子伴侣,筛选出tig分子伴侣对hTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用,可溶性表达量约占总量的90%;对优化后的hTNFR1表达系统的可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶酶切去除N端的Nus A标签,结合Western blot分析鉴定,获得了大量高纯度的hTNFR1蛋白。研究结果为进一步研究hTNFR1的生理学活性及其在疾病治疗方面的应用奠定了良好基础。

色氨酸操纵子调控机制详析

色氨酸操纵子是最早被研究的细菌合成代谢调控、基因表达调控的模型之一。其中阻遏蛋白对转录起始的抑制作用、色氨酸作为辅阻遏物的作用以及通过定点突变揭示的弱化作用的分子机制已基本被阐明。此外,色氨酸操纵子RNA结合弱化蛋白、NusA、Nus G、Trp Y等调节蛋白对细菌色氨酸操纵子弱化作用的调节机制也在近年来得到进一步揭示。特别是在枯草芽孢杆菌中,色氨酸操纵子主要依赖于转录衰减机制调控,包括由色氨酸激活的色氨酸操纵子RNA结合弱化蛋白与新生转录产物结合形成内部终止子,导致5’非翻译区(5’UTR)转录终止。Nus A、Nus G通过刺激RNA聚合酶在5’UTR的U107和U144位点暂停,释放出RNA聚合酶,最终造成转录终止。不同的是,在U144位点NusA参与的转录弱化机制依赖其发夹结构,且NusA与RNA聚合酶作用促进了RNA结合弱化蛋白与新生转录产物的结合,使转录终止。而NusG是通过与非模板DNA链中的一段富含T碱基序列和RNA聚合酶同时互作,阻止了RNA聚合酶向下游移动,从而引起RNA聚合酶高效停滞。但在细菌操纵子中,绝大多数调节因子参与的弱化机制最终依赖于ρ因子,从而导致多达一半的转录终止事件发生。近年来,随着学科的发展,越来越多关于色氨酸操纵子调节机制新概念被挖掘报道,这也使人类对色氨酸操纵子的表达调控机制的认知愈加详尽。