食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测技术研究进展

近年来,因食源性致病菌造成的食品中毒正在不断增加,严重威胁了人类的健康,大肠杆菌(E.coli)O157∶H7由于其低感染剂量和高致病性等特点引起了研究人员和世界卫生组织的高度重视。因此精准快速的检测食品中的E.coli O157∶H7对食品安全问题有着重要的意义,是预防和控制食源性疾病传播的重要技术,为此本文对E.coli O157∶H7的常规检测方法、免疫学法、分子生物学法和其他方法进行论述,介绍了这些方法的优缺点,对各种方法进行了整体比较,以期为有关工作者在选择检测方法或研发新方法提供参考。

纳米金与纳米金花标记的免疫层析法的建立及快速检测大肠杆菌O157∶H7的比较研究

为实现大肠杆菌O157∶H7早期现场的快速检测,该试验通过化学还原法与介导生长法制备了AuNPs与AuNFs作为标记探针,建立2种用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测的免疫层析试纸条,并对2种试纸条的的灵敏度、特异性和准确性进行检测。结果显示,所建立的2种免疫层析方法均可在15 min内检出食品中的大肠杆菌O157∶H7,其中AuNP试纸条最低检出限为3.2×10^(5)CFU/mL,AuNFs试纸条最低检出限为3.2×10^(4)CFU/mL,与单增李斯特菌、沙门氏菌、坂崎肠杆菌等常见食源性致病菌没有交叉反应。对人工污染果冻、牛奶和牛肉等样品AuNPs试纸条分别在前增菌5、6、5 h时检出,AuNFs试纸条分别在前增菌5、5、4 h时检出,且不受食品复杂机制的影响。结果表明,所建立的2种免疫层析试纸条灵敏度高、特异性强、操作简便,适用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测。

大肠杆菌O157∶H7微滴数字PCR定量方法的建立

以大肠杆菌O157∶H7（E.coli O157∶H7）rfb E基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR（dd PCR）方法。对dd PCR反应中的探针浓度进行了优化,考察了方法的线性范围、精密度、定量限和检出限。最终确定dd PCR反应中的最佳探针浓度为300 nmol/L。E.coli O157∶H7基因组DNA浓度范围为4-1.25×105拷贝/20μL dd PCR反应液时,dd PCR方法线性相关系数（R2）为0.999。当DNA浓度为760-88400拷贝/20μL时,方法的精密度最好（RSD〈5%）。本方法的定量限为4拷贝/20μL,检出限为3拷贝/20μL。特异性验证结果表明,建立的dd PCR方法特异性良好,对13份猪肉、牛肉和鸡肉样品的检测结果与定量PCR方法检出结果一致。

我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析

目的了解我国部分省区分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株特异基因和毒力基因携带特点及在不同动物宿主来源的菌株分布情况。方法采用PCR对分离菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因进行检测。结果在1992-2006年收集的O157及H7抗原阳性的345株大肠埃希菌株中,rfbEO157、fliCH7特异基因均为阳性,eaeA和hlyA的阳性率分别为99.4%和99.1%,stx2的阳性率为91.9%,stx1阳性率仅为13.3%,stx1+stx2的阳性率为13.0%,来源于病人和动物菌株的stx2阳性率均高于stx1。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主。携带毒力基因的O157∶H7菌株在羊、牛等动物宿主中广泛存在。结论 stx2是病人及羊、牛等动物来源的产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7携带的主要毒素基因型。

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfb E和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参(internal amplification control,IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应(polymease chain reaction,PCR)检测方法。结果表明,该方法对E.coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/m L;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999)。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E.coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E.coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生。

广西畜禽大肠杆菌O157∶H7流行病学调查

目的为了掌握广西畜禽大肠杆菌O157∶H7的流行病学情况。方法应用细菌分离、生化特性鉴定、血清凝集反应和PCR鉴定等方法在2007-2010年广西200多个畜禽养殖场进行畜禽大肠杆菌O157∶H7的流行病学调查。对采集的2 915份样本进行了大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定、致病性试验、药物敏感试验以及毒力基因检测。有5份样本经细菌培养特性、生化特性、血清凝集反应和PCR鉴定为大肠杆菌O157∶H7,样本细菌分离率为0.17%。小白鼠致病性试验显示分离菌株的毒力各有差别,对小白鼠的致死率在33.4%～100%之间。药敏结果表明分离菌株对阿莫西林、氨苄西林、多粘菌素B、罗红霉素、利福平和林可霉素不敏感。毒力基因的检测结果表明,5株分离菌株携带的毒力基因略有差异,并与其致病性强弱有一定的相关性。结论大肠杆菌O157∶H7主要在猪群传播,具有一定的毒力,对常用抗生素耐药。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)脂多糖(LPS)抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖(O-SP),并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

纳米金标记抗体增强SPR检测大肠杆菌O157∶H7

将金纳米粒子(AuNPs)标记的大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)的多克隆抗体(PAb)作为二抗,采用氨基偶联法将PAb固定在传感器表面作为一抗,通过三明治方法用双通道表面等离子体子共振(SPR)传感器对E.coli O157∶H7进行检测,并与SPR直接法检测进行了比较.结果表明,直接法的检出限为103cfu/mL,线性范围为103～109cfu/mL;AuNPs增强三明治法的检出限为10 cfu/mL,线性范围为10～1010cfu/mL,灵敏度比直接法提高了100倍,且具有更宽的检测范围.本方法不仅检测时间短,而且具有良好的选择性和重现性.

免疫磁分离技术在E.coli O157∶H7检测中的应用

免疫磁分离(i mmunomagnetic separation)技术因其具有选择性好、特异性强、能起到浓缩的作用,已与其他快速检测方法如电化学、光学等方法连用,应用于食品、环境卫生检测等领域。免疫磁分离技术是目前最有推广价值的技术之一。文章通过比较不同的E.coli O157∶H7-免疫磁珠(immunomagnetic beads,I MB)浓度配比、E.coli O157∶H7与Bacillus subtilis不同的体积比下的免疫磁分离的捕获率,得出当E.coli O157∶H7-I MB浓度配比为1∶30时,捕获率近100%,即所有的目标菌均可被捕获到;在总体积不变、IMB的加入量一定的情况下,随着Bacillus subtilis比例的增加,捕获率出现先下降后上升的情况。同时,将IMS与ATP生物发光法结合起来,对不同浓度的E.coliO157∶H7进行了检测,得出该方法与传统的平板培养法具有很好的线性相关性,则R2=0.9882,检测限可低达102CFU.mL-1。

牛源大肠杆菌O157∶H7分离与鉴定及其毒力基因检测

目的研究新疆肉牛主产区健康牛群中该菌的携带情况及致病的可能性。方法对采自新疆伊犁昭苏县某牛场健康牛的85份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR技术和生化试验鉴定;对分离到的E.coli O157∶H7用PCR法检测其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因携带情况;用腹腔注射EC肉汤增菌原液的方法进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。结果 85份粪样中只鉴定出1株E.coli O157∶H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因;攻毒实验所有的小白鼠于24h内全部死亡。结论新疆伊犁地区牛群携带有E.coli O157∶H7,从所分离到菌株所携带的毒力基因情况和对小白鼠攻毒实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性。

大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考耐药机制的初步研究

目的研究大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性产生的机制。方法本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将E.coli O157∶H7诱导成为氟苯尼考高度耐药菌株,采用无抗生素压力下连续传代培养或SDS方法将耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,使用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR,通过外排泵抑制剂与氟苯尼考联合使用,检测E.coli O157∶H7是否存在对氟苯尼考的主动外排作用。结果经过36代的耐药诱导,敏感菌株对氟苯尼考产生了高度耐药(MIC为256μg/mL)。质粒检测结果显示,耐药诱导菌株出现2个质粒,大小分别约为3 500bp和1 200bp,floR基因位于质粒DNA中。经连续传代培养或SDS法进行耐药消除,耐药诱导菌株对氟苯尼考的敏感性提高,但其质粒和floR基因均未丢失。结论 E.coli O157∶H7氟苯尼考敏感菌和耐药菌均存在对氟苯尼考的质子驱动型外排泵和ATP水解依赖型外排泵主动外排作用。

大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

用E.coliO157∶H7菌体免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了16株分泌单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。其中,1D3、2E7和2H7三株为O157∶H7特异单克隆抗体,Ig亚类分别为IgMκ、IgG2bκ和IgG2bκ,腹水抗体ELISA效价分别为103、105和106。用纯化的单克隆抗体2E7标记胶体金,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜（NC）上;组装成双抗夹心法O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157∶H7,敏感度为106CFU/mL,与相同单克隆抗体2H7和2E7建立的O157∶H7夹心ELISA检测方法的敏感度相当,试纸条简便快速,在1~5 min内可得出检测结果,便于O157∶H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。

出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体制备及免疫胶体金试纸条的研制

将骨髓瘤细胞SP2/0与出血性大肠杆菌O157∶H7免疫小鼠得到的脾细胞融合,通过筛选得到3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3、E7、B9,D3和B9亚类为IgG1,E7亚类为IgG2a,轻链亚型均为κ。交叉反应结果显示这3株单抗仅结合出血性大肠杆菌O157∶H7,对15株其他细菌无反应,测得胶体金标记单抗最佳pH、最佳结合量分别为D3:pH 7.5~8.0、24μg/mL;B9:pH 7.5、12μg/mL;E7∶pH7.5、18μg/mL,抗体配对选择胶体金结合D3喷涂金标垫、E7以1 mg/mL喷涂NC膜作T线为最优组合,试纸条检测出血性大肠杆菌O157∶H7灵敏度为2.1×106CFU/mL,且仅可检出出血性大肠杆菌O157∶H7,对25株其他细菌均无交叉反应,模拟带菌实验表明,对市售面包、牛奶、果冻各25 g(mL)均添加约200 CFU出血性大肠杆菌O157∶H7,增菌培养8、10、10 h即可检出。研究表明,实验自主制备的抗体性能良好,试纸条特异性、灵敏度达到国外同类产品,可在政府食源性致病菌监管部门、食品企业推广运用。

猪源大肠杆菌O157∶H7体外氟苯尼考耐药诱导及对抗菌药物敏感性变化研究

为初步研究猪源大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性的产生和消除机制,本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将两株猪源大肠杆菌O157∶H7诱导成氟苯尼考高度耐药菌株,采用无氟苯尼考压力下连续传代培养的方法将获得的氟苯尼考耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,检测耐药诱导菌和耐药消除菌对抗菌药物的敏感性,并检测菌株质粒携带的耐药基因。结果显示,经氟苯尼考耐药诱导,猪源大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考、阿莫西林、头孢唑啉、头孢拉定和头孢噻吩由敏感变为耐药,对头孢噻肟的敏感性由敏感变为中介,对氧氟沙星、环丙沙星和阿奇霉素由中介变为耐药;而经耐药消除后,菌株恢复对上述药物的敏感性;在菌株的质粒中检测到氟苯尼考耐药基因、喹诺酮类耐药基因和β-内酰胺酶基因,与耐药表型相符。结果表明,在氟苯尼考压力的长期存在下,猪源大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考产生耐药,且对青霉素类、头孢类和喹诺酮类药物产生交叉耐药,在去除氟苯尼考压力下连续培养,可消除菌株的部分耐药性。

基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测

目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）,建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌（310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌）的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中（标准法）100株肠道细菌（47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌）的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列。Clustal X软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌,其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3～26、2～9、2～32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1～20、1～6、2～27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列（S1-1,S1-2,S1-3）和1条独特间隔序列（S2-1）。间隔序列比对结果显示,S1-1＋S1-2＋S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6%和99.3%。基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来。大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类。结论基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具。

免疫磁珠富集法对牛源大肠杆菌O157∶H7分离鉴定的影响

为证明免疫磁珠吸附技术对牛源大肠杆菌O157∶H7分离效率的影响,从新疆五家渠市、伊宁县、昌吉市3个牛场的采集18份粪样、162份肛拭子、10份饲料样、17份水样和36份胴体表面棉拭子样本,经EC肉汤增菌后,分别采用免疫磁珠富集后和直接进行SMAC和MUG试验进行选择性培养,然后对菌体rfbE基因和鞭毛fliC基因进行PCR检测,最后对疑似大肠杆菌O157∶H7菌用生化试验进行符合性检测。结果2种方法分别从243份样品中分离到8株和4株大肠杆菌O157∶H7,统计学分析该差异不显著。本试验结果表明,在实践中免疫磁珠吸附技术和普通方法相比虽然在统计学上差异不显著,但确实能够增加大肠杆菌O157∶H7的分离数量,这与以前的相关研究结果基本一致。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。

猪源大肠杆菌O157∶H7耐药表型和消毒剂抗性调查

为了调查广西猪源大肠杆菌O157∶H7分离株的耐药表型和消毒剂抗性情况,本研究测定5株猪源大肠杆菌O157∶H7广西分离株的药物敏感性和消毒剂抗性,并应用PCR对5株细菌的耐氨基糖苷类抗生素基因:氨基糖苷磷酸转移酶基因aph(3)-Iia、乙酰转移酶基因aadA和aadB进行扩增。27种抗菌药物的敏感结果表明,5株菌株只对氟苯尼考、头孢曲松、头孢西丁和头孢噻肟敏感;对罗红霉素、多黏菌素B、利福平、林可霉素、阿莫西林、氨苄西林和头孢噻吩的耐药率为100%;对壮观霉素、链霉素、头孢拉定等药物的耐药率在20%～60%之间。在5株大肠杆菌O157∶H7广西分离株中,分别有1株、1株和3株菌株对23种、11种和9种抗菌药产生耐药性。PCR结果证实,5株细菌携带有耐氨基糖苷类抗生素基因,耐药基因的存在与其耐药表型有一定的相关性。消毒剂抗性结果显示,5株细菌对聚维酮碘溶液、新洁尔灭消毒液、稀戊二醛溶液、双季铵盐—碘消毒液、复方过氧乙酸具有抗性,只对二氯异氰尿酸钠粉敏感。研究结果对预防和控制广西大肠杆菌O157∶H7提供了数据。

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌(E.coli)O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌(37℃、180 r/min),接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增(ERIC-PCR)指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。