棉花黄萎病菌鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白基因VdOAZ的功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌中鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白(OAZ)基因(VdOAZ)的功能。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdOAZ基因全长进行克隆并测序。构建针对VdOAZ基因的敲除载体和互补载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdOAZ基因敲除菌株和和互补菌株。以野生型菌株V592为对照,对VdOAZ基因敲除突变体和互补菌株的菌落生长速率、产孢量、微菌核产量及对棉花的致病力进行测定;通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应测定致病相关的其他基因在VdOAZ基因敲除突变体中的表达量,及亚精胺诱导条件下,V592菌株中VdOAZ基因及致病相关的其他基因的相对表达量。【结果】从棉花黄萎病菌中克隆到VdOAZ基因的全长为1 006 bp,具有2个开放阅读框(Open reading frame,ORF),ORF2编码的蛋白具有OAZ所特有的ODC-AZ保守结构域。与野生型菌株V592和互补菌株相比,VdOAZ基因敲除突变体的菌落生长速率降低、微菌核产量及产孢量明显减少,对棉花的致病力下降,表明VdOAZ基因与大丽轮枝菌分生孢子和微菌核的产生有关,并参与大丽轮枝菌致病。在VdOAZ基因敲除突变体中,VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2和VdSge1基因表达量显著上调;V592菌株经亚精胺诱导培养后,VdOAZ基因的表达量显著上调,而上述5个致病相关基因的表达量均明显下调,表明VdOAZ基因对其表达具有负调控作用。【结论】VdOAZ基因响应多胺水平改变,通过调控VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2、VdSge1的表达影响大丽轮枝菌孢子产生、微菌核形成和致病过程。

早期B细胞因子相关锌指蛋白基因的变异与中国人群狼疮肾炎发病的相关性研究

目的研究早期B细胞因子相关锌指蛋白(OAZ)基因内部的单核苷酸多态性(SNP)与中国人狼疮肾炎发病的相关性。方法选择OAZ基因内部阳性微卫星D16S517附近的8个SNP标记在184例系统性红斑狼疮(SLE)患者(83例狼疮肾炎患者和101例非狼疮肾炎患者)和286名正常人中进行等位基因分型,以Helixtree软件分析SNP分布情况。结果发现中国汉族人群中(1)SNPrs1344531等位基因(T)频率在SLE患者组(47.0%)和正常对照组(38.1%)中差异存在统计学意义(P=0.008);CC基因型的频率在SLE患者组(25.5%)显著低于正常对照组(38.1%,P=0.005)。(2)SNPrs1344531等位基因(T)频率在狼疮肾炎患者组(53.0%)和正常对照组(38.1%)中差异存在统计学意义(P=0.001);CC基因型的频率在狼疮肾炎患者组(22.9%)显著低于正常对照组(38.1%,P=0.013),TT基因型的频率在狼疮肾炎患者组(28.9%)显著高于正常对照组(14.3%,P=0.003)。(3)rs1420676rs1344531(CT)(P=0.001),rs3803665rs1420676rs1344531(CCT)(P=0.004),rs2292155rs3803665rs1420676rs1344531(CCCT)(P=0.002)等单倍型频率在狼疮肾炎患者组中较高。而rs1344531rs2080353(CA)(P=0.005),rs1344531rs2080353rs933564(CAG)(P=0.006)等单倍型的频率在狼疮肾炎患者组中较低。结论OAZ基因的变异可能在狼疮肾炎发病中发挥作用。

青蒿琥酯对狼疮鼠Olf-1/EBF相关锌指蛋白基因表达的影响

目的 探讨青蒿琥酯治疗对SLE患者外周血Olf-1/EBF相关锌指蛋白（OAZ）信号通路相关基因表达水平的影响.方法 应用随机数字表将24只12周龄MRL/lpr狼疮鼠分成2组,即狼疮对照组与青蒿琥酯治疗组,另取8只BABL/C作为正常对照组.采集并分离治疗前与治疗后4、8周狼疮鼠PBMCs,从细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,用实时荧光定量PCR技术分析不同分组OAZ信号通路相关基因OAZ、Id1-3 mRNA表达水平的变化,ELISA法测定上清液中IL-4、IFN-γ、B细胞活化因子（BAFF）、ANA浓度并分析这些因子分泌水平与OAZ基因表达的相关性.2组比较采用t检验,多个样本均数间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 治疗后8周,治疗组OAZ、Id1、Id3mRNA的表达水平（△Ct分别为12.9±0.8、12.0±0.4、10.2±0.8）与狼疮对照组（△Ct分别为9.8±1.0、9.3±1.1、8.1±0.8）和正常对照组（△Ct分别为13.9±1.2、11.4±0.7、4.7±0.8、10.3±1.0）比较差异有统计学意义（F=7.46,P=0.008; F=6.37,P=0.032; F=5.63,P=0.042）,且OAZ基因mRNA表达水平△△Ct值与Id1、Id3表达水平△△Ct值呈正相关（r=0.867,0.947;P均＜0.05）;其血清IL-4、BAFF浓度,ANA的吸光度值均较治疗前显著降低,IFN-γ较治疗前显著增高（P＜0.05）,OAZ基因mRNA表达水平△△Ct值与Th1/Th2比值呈正相关（r=0.976,P＜0.01）,与ANA吸光度比值、BAFF浓度比呈负相关（r=-0.955,r=-0.937;P＜0.05）.结论 青蒿琥酯治疗SLE可降低患者外周血中OAZ及其下游基因表达,同时减低多种细胞因子及ANA水平,推测OAZ信号通路可能是青蒿琥酯治疗SLE有效机制之一.