慢病毒载体介导HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞的影响

目的观察在体外培养条件下,慢病毒载体介导的HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞生物学特性的影响及基因的表达情况。方法利用本室分离鉴定保存的树鼩BM-MSCs,构建含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体,并分别将CD81和OCLN基因转染到BM-MSCs中,荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测转染效率,CCK8法检测转染后BM-MSCs的细胞增殖情况,成骨成脂细胞诱导分化检测其多向分化潜能。采用实时荧光定量及WB方法检测HCV受体(OCLN/CD81)基因mRNA和蛋白表达情况和转染后BM-MSCs干性基因的表达。结果以MOI为100转染含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体后,LV-CD81转染效率达99.4%,LV-OCLN转染效率22.6%。细胞增殖趋势与未转染基因的BM-MSCs相似,转染后的BM-MSCs仍可以向成骨成脂细胞分化,但能力有所下降。干性基因NANOG mRNA表达增高,差异有显著性(P<0.05),LIN28A mRNA表达下降,差异有显著性(P<0.05)。转染后树鼩BM-MSCs能高效表达所转入的外源基因。结论构建的含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体可以成功转染树鼩BM-MSCs,并高效表达所转入的基因,转染后对树鼩BM-MSCs的多向分化潜能有一定的影响。

丙肝感染宿主亲嗜性基因OCLN和CD81在猕猴川西亚种组织中的分布

丙型肝炎动物模型缺乏限制了丙型肝炎的研究,如果与人类基因背景相似的猕猴能作为丙型肝炎动物模型将有重大意义。文章拟通过检测决定HCV感染物种特异性的关键基因OCLN与CD81在猕猴不同组织的表达量,并以HCV易感的人肝癌细胞系Huh 7.5.1为对照,来探究猕猴作为丙型肝炎动物模型的可能性。结果表明,OCLN与CD81在猕猴川西亚种的肝脏、脾脏、肺脏、淋巴结和脊髓中均有表达,但表达量均极显著低于在Huh 7.5.1细胞系中的表达量(P<0.01)。肝脏中的OCLN表达量略低于肺脏中的表达量,而肝脏CD81的表达量均高于其他组织。并且,OCLN在不同组织中的表达水平与人体OCLN表达规律相符合(脾<肝<肺)。该结果提示HCV感染的宿主亲嗜性基因OCLN与CD81在猕猴中的低表达量可能导致HCV不能有效地结合组织靶细胞,因此推测,猕猴不能直接用于丙型肝炎动物造模可能与此有关。今后可通过转基因等技术增强OCLN与CD81基因的表达,从而使猕猴获得直接感染HCV的能力。

血清CLDN5、OCLN和ZO1与颅脑损伤急性期患者损伤程度及预后的关系

目的探讨非开放性颅脑损伤急性期患者血清中封闭蛋白5(CLDN5)、密封蛋白(OCLN)和紧密连接蛋白1(ZO1)的含量与患者损伤严重程度及预后的关系。方法收集2014年2月至2015年2月非开放性颅脑损伤急性期患者92例。患者入院后立即留取外周血,检测血清中CLDN5、OCLN和ZO1的含量,分析三者与患者格拉斯哥昏迷评分(GCS)、颅内血肿体积的关系以及对患者预后的判断价值。结果不同GCS的患者间血清CLDN5和OCLN含量均有统计学差异(均P<0.05);不同血肿体积的患者间CLDN5和OCLN含量均有统计学差异(均P<0.05);死亡患者的血清CLDN5和OCLN含量明显高于存活组(均P<0.05),在不同GCS、血肿体积和预后的患者间比较,ZO1含量均无统计学差异(均p>0.05)。GCS与血清CLDN5、OCLN含量均呈负相关(r_(CLDN5)=-0.84,r_(OCLN)=-0.85,均P<0.01),与ZO1无相关性(r_(ZO1)=0.14,P>0.05);血肿体积与血清CLDN5、OCLN和ZO1含量均呈正相关(r_(CLDN5)=0.82,r_(OCLN)=0.93,r_(ZO1)=0.82,均P<0.01)。结论血清CLDN5、OCLN可以作为急性颅脑损伤患者病情严重程度和预后判断的有效生物标志物。

硅烷化玻璃酸酯对皮肤屏障相关基因和蛋白的作用研究

主要通过qRT-PCR及免疫荧光(IF)法,研究了硅烷化玻璃酸酯(SHAC)对于皮肤屏障相关的8种基因表达和2种屏障相关蛋白合成的影响。选取合适样品浓度检测培养24 h后角质形成细胞中的FLG、LOR、IVL、KRT10、KRT16、TGM1、CLDN1、OCLN 8种基因表达量,同时检测角质形成细胞中ZO-1、CLDN1 2种蛋白的表达量。结果表明,SHAC在浓度0.625%时能显著促进IVL、TGM1、OCLN、CLDN1基因的表达,在浓度为2.5%时能显著促进OCLN、TGM1基因的表达;当SHAC浓度在0.625%时,能更好促进CLDN1基因的表达并能显著促进CLDN1蛋白含量上升,对ZO-1蛋白作用不明显,SHAC具有潜在的屏障修护作用。

紧密连接蛋白Occludin影响牛病毒性腹泻病毒感染

为了研究紧密连接蛋白Occludin(OCLN)在调控牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)胞内复制中的重要作用。使用Benchling平台设计OCLN的向导RNA(short guide RNA,sgRNA)序列,克隆至LentiCRISPR V2质粒中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(madin-darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,使用Western blot检测OCLN敲除情况,建立OCLN敲除MDBK细胞系;于BVDV感染OCLN KO细胞不同时间,使用荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)检测BVDV 5’非编码区(untranslated region,UTR)mRNA和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)水平;使用Reed-Muench法测定BVDV感染OCLN KO细胞不同时间后病毒滴度;使用倒置显微镜观察BVDV感染OCLN KO和MDBK细胞不同时间后致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)情况;使用qRT-PCR检测OCLN KO细胞中BVDV吸附和内化情况。结果发现,与Scramble处理组相比,OCLN KO细胞中OCLN蛋白表达显著性降低,BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA水平显著性降低,BVDV滴度显著性降低,BVDV感染造成的细胞CPE明显减弱,BVDV吸附和内化作用明显减弱。表明OCLN敲除后显著性抑制BVDV通过吸附和内化作用进入MDBK细胞,将为抗BVDV的新方法和技术建立提供依据和重要靶点。