OE-PCR快速合成基因的探索研究

根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好性的基因,而且一次向野生型Cip基因里引入了12个点突变,并可以低成本、低错误率甚至是正确无误地合成1.5 kb以内的任何已知基因。

OE-PCR法扩增获得犬瘟热病毒缺失疏水区的融合蛋白基因片段

根据犬瘟热病毒(CDV)O nderstepoort株的核苷酸序列,设计合成引物,通过RT-PCR,从CDV O nderstepoort株RNA中扩增出2 197 bp的CDV全长融合蛋白(F)基因。将其与pGEM-T easy载体连接,通过软件分析其序列中的疏水区后,以pGEM-T/F为模板,PCR扩增出约254 bp和1 017 bp的F蛋白疏水区外编码序列。以2个扩增产物为模板,以OE-PCR(overlap ex tens ion-PCR)扩增出约1 271 bp的缺失疏水区的F基因(dF),测序结果表明,dF的序列除在疏水区以4个甘氨酸序列替代外,其余部分与F基因的同源性为99.2%。这表明,OE-PCR扩增法已成功地使CDV F基因疏水区缺失。

一种高效而经济获得长片段基因突变体的方法

重组PCR方法的发展为体外突变技术提供了更快捷、准确的方法.通过改进引物设计和PCR保真性等方法,应用重叠延伸PCR的原理成功地实现了对BA基因的定点突变,并构建了其含有m1,m2,m3和m4的突变体.实验证明通过这种改进方法可以有效地进行长片段基因的突变,并且这种方法与其他方法相比具有简便、快捷、经济、高效的特点.

禽流感病毒M2蛋白跨膜区基因的缺失

根据禽流感病毒 (AIV ) A/ Chicken/ Korea/ MS96 / 96 (H9N2 )株的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过 RT- PCR,从AIV H9N1株感染的 MDCK细胞总 RNA中扩增出 2 94 bp的 AIV全长的 M2基因。通过软件分析其序列中的跨膜区后 ,将其与p GEM- T easy载体连接产物 p GEM- T/ M2为模板 ,通过 PCR扩增出约 90 bp左右 M2的膜外区编码序列和约 16 0 bp左右 M2的胞内区编码序列。将两个扩增产物同时作为模板 ,以 OE- PCR(overlap extension- PCR)扩增出约 2 5 0 bp的缺失跨膜区的 M2基因M2 d。测序结果表明 ,M2 d的序列除在跨膜区以 4个甘氨酸序列替代外 ,其余部分与 M2完全一致 ,由此说明 OE- PCR扩增法成功地将禽流感病毒

重叠延伸PCR合成血管内皮生长因子基因

目的:重叠延伸PCR(OE-PCR)方法合成人血管内皮生长因子(VEGF)基因。方法:根据Genbank中人VEGF基因的编码序列合成15个寡核苷酸片段,相邻引物间均有19个碱基互补,经过7轮PCR循环扩增出人VEGF基因,并将其克隆至pMD18-Tvector,挑取3个重组质粒进行筛选并测序。结果:酶切和测序鉴定结果表明,其中一个与VEGF的同源性达到100%。结论:动态模板OE-PCR基因合成法成功获得576bp的VEGF全长DNA。

猪IκBα基因定点突变中两种方法的应用

作者将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸,为进一步研究突变型IκBα蛋白对异种移植延缓性排斥反应的抑制机理奠定基础。首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。说明两种突变方法各有所长,又有各自的缺点,应根据试验的实际需要灵活选择合适的突变方法,以收到事半功倍的效果。

基因组装技术在合成生物学中的应用

基因组装技术是合成生物学领域近年来发展起来的新型技术。它基于大规模基因组数据分析,发现新型的或隐藏的生物活性物质合成基因簇。利用基因组装技术,可提高或激活沉默的生物合成基因簇在微生物中的表达,从而合成潜在的、有价值的生物活性物质。本文旨在阐明最新的体内和体外基因组装技术的设计原理、关键策略及其应用。基因组装技术是合成生物学、代谢工程和功能基因组学研究的重要工具,对生物活性物质的高效生产及合成具有重要意义。