稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因在毕赤酵母中的表达

根据酵母表达系统的密码子偏爱性、poly(A)信号以及外源基因mRNA5’端的二级结构等特性 ,对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)ORF6基因进行简并改造和人工合成 ,然后以正确的读码框架插入到分泌型酵母高效表达载体pPICZαA的α因子信号肽编码序列 3’端 ,构建成酵母转移载体 ,用化学方法转化受体酵母菌GS115 ,经PCR和酶切鉴定证实 ,目的基因已整合到重组酵母菌染色体中。对重组酵母进行诱导表达 ,并通过SDS_PAGE和Westernblot分析进行筛选 ,获得了一株高效表达目的蛋白的重组酵母菌 ,该重组蛋白具有免疫学活性 ,其表达水平可达 2 .0g/L 。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达载体pET-ORF6。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSVORF6基因获得表达。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体。经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应。兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础。

两株高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因克隆及序列分析

应用RT—PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7，将其分别克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列，并与VR-2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较，并绘制系统进化树，结果ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型的同源性为91．1％～100％，与欧洲型的同源性为66．2％～70．7％，推导氨基酸与北美洲型的同源性为91．2％～100％，与欧洲型的同源性为62．3％～82．3％。证明新分离到的PRRSVSX株、ZQ株仍属北美洲型。SX株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．8％、100％；ZQ株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99．6％、99．7％。

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达

为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株。以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和West-ern blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达。

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明：该10株病毒仍属北美洲型,其中2001-2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株（VR-2332株）和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006-2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%-100%,99.4%-99.8%,99.2%-99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株（JXA1、Shanghai、HEB1）同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。

斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中选取8株国内报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株,应用DNAStar软件对其ORF6、ORF7基因序列进行分析,与VR-2332株、LV株、国内及周边国家分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树.结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的ORF6、ORF7核苷酸与VR-2332株的同源性为95.1%-95.4%、93.8%-94.1%,与欧洲型（LV）的同源性为69.4%-69.6%、67.9%-68.5%;ORF6、ORF7推导氨基酸与VR-2332株的同源性为97.7%、94.4%-95.2%,与欧洲型（LV）的同源性为80.0%-80.6%、65.3%-66.1%.系统进化树表明,8株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株仍属于美洲型.说明猪繁殖与呼吸综合征病毒不断变异的现今,ORF6和ORF7基因依然高度保守.

肺炎支原体ORF6区蛋白重组抗原制备及在血清学诊断中的初步应用

目的本文应用肺炎支原体ORF6区重组抗原建立酶联免疫吸附实验(ELISA),用于检测肺炎支原感染者IgM抗体。方法通过已构建的质粒表达重组蛋白,用电洗脱法纯化后建立ELISA试验,并检测临床标本224份,与国外2种商品化试剂盒检测结果对照,初步考核检测方法的敏感性和特异性。结果与进口试剂盒相比阳性率基本相符,统计分析无显著差异。结论研究建立的间接ELISA方法特性强、敏感度高,为试剂盒的研制与开发奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4ORF6基因的克隆与序列分析

将猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRS)病毒 BJ- 4株在 HS.2 H细胞上增殖 ,经超速离心浓缩病毒。用 TRIZOL LS试剂提取病毒基因组 RNA后 ,用 RT- PCR方法特异性扩增 PRRS病毒 BJ- 4的 ORF6基因片段 ;经Sma 酶切鉴定正确后 ,将 PCR产物克隆到p GEM- Teasy载体上 ,经 Amp/IPTG/X- Gal平板筛选、酶切鉴定和质粒 PCR鉴定 ,初步获得含 ORF6基因的阳性重组质粒 p GEM-T- ORF6。对重组质粒进行序列测定 ,并同美洲代表株 VR2 332和欧洲代表株 L V进行比较 ,结果表明 ,BJ- 4 ORF6与 VR2 332的ORF6差异较小 ,核苷酸和氨基酸同源性均为 99.43% ;而与 L V株的差异性较大 ,核苷酸同源性为 70 .6 % ,氨基酸同源性为 77.4%

肺炎支原体ORF6区基因的克隆与表达

目的表达肺炎支原体ORF6区基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增ORF6区基因,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的蛋白的表达结果。结果获得肺炎支原体ORF6区基因长为1003bp的DNA片段,SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量56.8kDa处有阳性表达条带。免疫印迹显示,该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应。结论ORF6区基因在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白具有免疫反应性。

PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

以PRRSV细胞培养物为模板,经RT-PCR扩增得到ORF5/ORF6基因,该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切,连接构建pIRES-ORF5/ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5/ORF6。测得的ORF5/ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99%和100%,属北美洲型。

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。

空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中作用的研究

〔目的〕研究空肠弯曲菌脂多糖基因ORF6在脂多糖生物合成中的作用。〔方法〕通过同源搜索 ,推测基因ORF6的可能功能 ;通过PCR扩增基因ORF6,将基因ORF6插入质粒载体pBluescript中 ,再通过抗卡那霉素弹夹的插入 ,使基因ORF6失活 ;通过自然转移 ,失活的ORF6基因与野生株空肠弯曲菌的常染色体融合而产生突变株 ;通过银染色、蛋白质印迹对突变株脂多糖进行分析 ;结合同源搜索的结果 ,推测基因ORF6的可能功能。〔结果〕ORF6DNA序列与鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和脆弱类杆菌 (Bacteroidesfragilis)的转氨酶基因相似 ;通过自然转移得到基因ORF6失活突变株 ;基因ORF6突变株的脂多糖比野生株的脂多糖短 ,基因ORF6的改变影响空肠弯曲菌血清反应。〔结论〕基因ORF6在脂多糖的生物合成中起着重要作用 ;基因ORF6很可能是一种氨基转移酶。

斑点叉尾病毒囊膜蛋白ORF6在昆虫细胞中的表达

为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状病毒介导下在昆虫细胞中表达,从而为基于CCV ORF6的杆状病毒亚单位疫苗研究奠定了基础。

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒(CyHV-2)ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞(GiCF);利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株ORF6基因的克隆、鉴定及真核表达

旨在获得HP-PRRSV TA-12(GenBank登录号:HQ416720)分离株ORF6蛋白的高效表达,将HP-PRRSV TA-12分离株的ORF6基因克隆到载体PfastBac HTB,并经转座进入E.coli含有杆状病毒质粒Bacmid的DH10BacTM细胞株,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定出阳性重组杆粒,再将提取的重组杆粒Bacmid-ORF6转染昆虫细胞sf9,使其表达ORF6蛋白。经Western blot鉴定,在感染重组杆状病毒后第4天ORF6蛋白表达量最大,达到0.05μg/μL。表达的ORF6蛋白主要存在于细胞质中。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因的克隆与序列分析

以期从结构上阐明猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的生物学特性,为研究病毒的基因功能和遗传变异提供资料。本文采用RT-PCR技术,对NV/Nx/2008猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF6基因进行了克隆,并对其序列进行比对,结果显示M蛋白在蓝耳病各血清型间高度保守;分子中含有2个糖基化位点及多个酪蛋白激酶II、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点和氨基化位点;空间结构和烟酰胺核苷酸转氢酶结构域III的空间结构相似。

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF6基因的克隆

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，该病毒0RF6基因编码的膜基质蛋白又称M蛋白。根据Gen—bank上公布的PRRSVVR2332M基因核苷酸序列设计了一对特异性引物．并应用RT—PCR方法扩增出M蛋白的目标基因。将PCR产物克隆到pMDl8－T载体，筛选获得重组质粒PMD—M，并将其转入受体菌DH5a感受态细胞中，通过电泳检测分析获得PRRSVM基因。该研究对于PRRS的流行病学调查、病原学研究及诊断均具有重要意义。