羊口疮病毒ORFV113蛋白的转录动力学、真核表达及亚细胞定位

旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析;在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下,于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞,提取细胞总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因,确定ORFV113的动态转录水平;以ORFV-JS株基因组为模板,PCR扩增ORFV113基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV113重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞,通过Western Blotting鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明,ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守,属于ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒,ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,大小为60~70 ku,比预测分子量大10~20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰;亚细胞定位研究表明,ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上,本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。

羊口疮病毒ORFV113蛋白的主要特性及B细胞和T细胞抗原表位预测

为了预测羊口疮病毒ORFV113蛋白的主要特性及其优势B细胞和T细胞抗原表位,分别利用在线软件ProtParam预测ORFV113蛋白的理化性质,DeepTMHMM预测其跨膜区,SignalP 6.0预测其信号肽,SOPMA预测其二级结构,PSORT预测其亚细胞定位,ABCpred预测其优势B细胞表位,IEDB预测其优势细胞毒性T细胞表位。结果:ORFV113蛋白由208个氨基酸组成,为不稳定亲水性蛋白,分子质量约22.08 ku,理论等电点(PI)为4.36,在3~25 aa处存在1个跨膜区,不含信号肽,主要定位于细胞质膜;ORFV113蛋白的二级结构由延伸链(16.35%)、α-螺旋(23.08%)、β-转角(4.81%)、无规则卷曲(55.77%)组成;ORFV113蛋白存在11个优势B细胞表位,分别位于164~179 aa、62~77 aa、132~147 aa、120~135 aa、138~153 aa、101~116 aa、56~71 aa、188~203 aa、175~190 aa、49~64 aa、108~123 aa;存在3个优势T细胞表位,分别位于63~71 aa、121~129 aa、162~170 aa。结论:ORFV113蛋白为亲水性的跨膜蛋白,含有多个优势B细胞和T细胞抗原表位,可作为多表位疫苗的靶点。

靛玉红对ORFV感染淋巴细胞的增殖、细胞因子含量及CD分子表达量的影响

为了研究靛玉红对羊传染性脓疱病毒(Ovine contagious pustular dermatitis virus,ORFV)感染淋巴细胞的增殖、细胞因子质量浓度及CD分子表达量的影响,在靛玉红对ORFV感染淋巴细胞增殖的影响试验中,分为对照组、ORFV感染组、靛玉红(0.2μg/mL)+ORFV组、靛玉红(0.2μg/mL)组,采用CCK-8法检测靛玉红对ORFV感染淋巴细胞增殖的影响。另外,在靛玉红对ORFV感染细胞上清液中细胞因子质量浓度及CD分子表达量的影响试验中,分为高浓度靛玉红(0.2μg/mL)+ORFV组、中浓度靛玉红(0.1μg/mL)+ORFV组、低浓度靛玉红(0.05μg/mL)+ORFV组,于96孔培养板中,每孔加入淋巴细胞悬液100μL,之后加ORFV病毒悬液100μL,吸附2 h,弃病毒液,分别加入终浓度为0.2,0.1,0.05μg/mL的靛玉红溶液100μL,作用0,2,4,8,12 h,另设ORFV感染组(只加ORFV病毒悬液和RDMI-1640完全培养基)、对照组(只加RPMI-1640完全培养基),采用ELISA方法检测细胞上清液中IFN-γ、TNF-β、IL-10的质量浓度及CD4、CD8的表达量,并计算CD4/CD8。结果表明:与ORFV感染组相比,靛玉红+ORFV组淋巴细胞增殖数极显著升高(P<0.01)。与ORFV感染组比较,作用4,8,12 h后,高、中、低浓度靛玉红+ORFV组的CD4分子表达量和CD4/CD8显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),同时Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-β质量浓度及Th2型细胞因子IL-10的质量浓度不同程度升高,而CD8分子表达量降低。说明靛玉红能够增强ORFV感染淋巴细胞的增殖,促进IFN-γ、TNF-β和IL-10的分泌,提示靛玉红可能是通过调节CD4、CD8的表达来促进细胞因子的分泌,增加ORFV感染淋巴细胞的增殖,进而调节机体的免疫机能。

羊口疮病毒疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因的比较分析

【目的】比较分析羊口疮病毒疫苗株与ORFV-PN株ORFV011基因的分子特点、编码蛋白的生物学功能差异,为福建省羊口疮的科学防控提供理论指导。【方法】对羊口疮疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因进行克隆和测序,运用生物信息学相关软件比较分析两者测序结果的差异。【结果】测序结果显示,疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因均由1137个核苷酸组成,编码378个氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比较显示,ORFVPN与疫苗株和弱毒株D1701株ORFV011基因核苷酸序列相似性分别为98.6%和98.4%,氨基酸序列相似性均为98.7%。与疫苗株相比,ORFV-PN株共有16处核苷酸变异和5处氨基酸变异。在蛋白二级结构上,ORFV-PN株和疫苗株α-螺旋占比分别为34.13%(129/378)和30.42%(115/378),β-转角占比分别为6.08%(23/378)和6.88%(26/378),无规则卷曲占比分别为37.30%(141/378)和39.15%(148/378),β-折叠占比分别为22.49%(85/378)和23.54%(89/378)。蛋白三级结构上,ORFV-PN株预测的三维结构与疫苗株的三维结构在α-螺旋和无规则卷曲上有一定的差异。【结论】福建省羊口疮病毒ORFV011基因出现变异,应当引起广大兽医工作者的重视,有关部门应当加强对羊口疮的监测。

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。

抗羊口疮病毒蛋白ORFV086多克隆抗体的制备及其应用

本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1∶128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。

羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位

【目的】对羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究。【方法】使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL对ORFV114蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷(cytarabine,Arac)存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染HEK293细胞,通过Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV114蛋白的亚细胞定位。【结果】ORFV-JS株ORFV114基因大小为1041 bp,在ORFV毒株中高度保守;ORFV114蛋白包含346个氨基酸,预测分子质量大小为38 ku;ORFV114为弱亲水性不稳定蛋白,无跨膜区域,无信号肽;其二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,分别占45.09%、25.14%、21.68%和8.09%;在Arac存在或不存在的情况下,ORFV114的转录在ORFV感染后2 h即可被检测到,且随感染时间的延长转录水平不断提高,即Arac并未抑制ORFV114转录,ORFV114为ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV114重组质粒,ORFV114-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,融合蛋白大小约65 ku;ORFV114蛋白主要定位在HeLa细胞的细胞质中且呈点状分布。【结论】本研究成功地对ORFV114蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位,为进一步探索ORFV114蛋白功能及筛选互作蛋白奠定基础。

羊口疮病毒凤翔株ORFV121和vIL-10基因的生物信息学分析

为分析羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因在凤翔(FX0910)强毒株(vORFV)和弱毒株(lvORFV)之间的差异,应用PCR方法扩增羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因的全长序列并测序,应用生物信息学软件分析基因的核酸、氨基酸相似性,蛋白的亲水性、二级结构以及抗原性。结果显示,lvORFV的ORFV121基因118位的谷氨酸缺失,说明该处发生的碱基突变为有意突变,该突变导致弱毒株相应蛋白的亲水性、二级结构发生变化,蛋白的抗原性在很多区域发生本质改变;vIL-10在蛋白质水平出现了5个氨基酸位点突变(14:V→W,49:A→P,57:T→M,72:R→C,102:I→V)和79位插入1个色氨酸。这些位点差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生了变化。ORFV121基因和vIL-10基因在vORFV和lvORFV之间存在差异,这些基因差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生改变。

羊口疮病毒ORFV129锚蛋白在山羊睾丸细胞中的亚细胞定位

为明确羊口疮病毒ORFV129锚蛋白在细胞中的定位,参照GenBank中收录的ORFV SY 17全基因组(登录号:MG 712417.1)序列设计引物,扩增ORFV129基因完整编码框并测序鉴定,利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的氨基酸序列、蛋白跨膜区域,预测其亚细胞定位;并将ORFV129完整基因连接到真核表达载体pEGFP-N1,经双酶切鉴定及测序鉴定是否成功构建重组表达质粒pEGFP-ORFV129;利用LipoGeneTM 2000介导将pEGFP-ORFV129转染新生山羊睾丸原代细胞,通过Western Blot鉴定ORFV129蛋白是否正确表达,同时,经DAPI核酸染料对细胞核进行染色后,激光共聚焦显微镜观察ORFV129蛋白的亚细胞定位。结果显示,成功扩增ORFV129完整基因,该基因全长大小为1551 bp,测序鉴定其正确;生物信息学分析发现,其编码516个氨基酸,含有8种锚蛋白ANKs重复基序(ANKs),不存在跨膜区域,亚细胞定位预测其蛋白主要定位于细胞质;Western Blot结果显示,转染了pEGFP-ORFV129重组质粒的山羊睾丸原代细胞中检测到了ORFV129蛋白的表达;亚细胞定位结果表明,ORFV129蛋白主要定位于细胞质,与预测结果一致。研究结果为进一步探明ORFV129蛋白在诱导机体免疫应答中的作用奠定了基础。

ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。

靶向ORFV-DNA ploymerase基因shRNA表达载体的构建

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(ORFV)引起的人畜共患的一种急性、接触性和具有高度嗜上皮性传染病,主要感染绵羊、山羊和人。由于该病缺乏全身性感染症状,因此在防治上也缺乏有效的疫苗或抗体。RNA干扰技术是目前较为成熟的抑制目的基因表达生物技术。ORFV的DNA ploymerase是病毒复制的关键酶。研究运用RNA干扰技术针对ORFV的DNAploymerase基因进行体外基因沉默研究,通过网络自动筛选平台设计并合成3个short-hairpin RNAs(shRNAs)片段,并与含U6启动子的pLL3.7质粒构建重组载体,结果表明pLL3.7-D596为重组阳性,进一步测序结果正确。研究可以为靶向ORFV-DNAploymerase基因的体内基因沉默提供参考数据。

羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡及免疫细胞因子的影响

旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上,成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞,Western Blot鉴定ORFV118蛋白表达的正确性;流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响;RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平,并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示,成功扩增ORFV118基因,全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平;可抑制细胞的凋亡作用,且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平;对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用,而对IL-6和TNF-α呈促进作用。

ORFV诱导HaCaT细胞CK1等分子mRNA转录波动

羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)可引起动物口唇等黏膜上皮异常角化,导致严重的增生性病变。由于临床存在复杂的患病风险,使ORFV感染早期对症治疗至关重要。因此,研究病毒对细胞增殖与分化的影响有助于筛选抗病毒路径。研究表明,角质形成细胞的增殖和分化进程直接受到角蛋白(CKs)等分子转换调控。为研究ORFV感染对CKs转换的影响,试验室利用ORFV-HaCaT细胞体外感染模型,通过RT-PCR方法检测病毒感染的不同时间段DSG3、Ki67和CKs转录水平。结果显示,DSG3、Ki67、CK2分子表达一直处于稳定,而CK1/CK10、CK5/CK14则在ORFV感染早期相继发生短暂的正向波动,但很快又受到病毒抑制,表明病毒会持续调节感染诱导影响细胞分化趋势。研究为深入探讨ORFV引起角质细胞CKs波动的分子机制奠定了基础。

颗粒蛋白前体PGRN通过增强ORFV诱导的自噬促进病毒的复制

颗粒蛋白前体(PGRN)是一种分泌型多功能蛋白,具有多种生物学功能,在炎症反应、创伤修复、溶酶体功能、自噬、神经发育等多种生命活动过程中发挥重要作用。课题组前期研究结果证实,ORFV能够诱导OFTu细胞发生自噬,作为细胞自噬的重要调控分子,PGRN是否参与对ORFV诱导OFTu细胞自噬的调控尚不清楚。本研究首先从转录和蛋白水平上分析PGRN在ORFV感染细胞中的表达变化规律,结果显示,PGRN发生显著上调的时间与ORFV诱导自噬发生的时间一致。进一步研究显示,敲低PGRN能够抑制LC3的型别转换,并使P62表达上调;而体外添加PGRN重组蛋白则促进LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转换,P62表达下调。以上结果表明,PGRN参与对ORFV诱导细胞自噬的调控。此外,病毒噬斑试验结果显示,PGRN能够促进ORFV复制,且可解除自噬抑制剂对病毒复制的抑制,该结果表明,PGRN能够通过调节ORFV激活的自噬影响病毒的复制。本研究结果将为明确PGRN对ORFV诱导自噬的调控作用及进一步揭示ORFV致病机制奠定基础。

羊IL-2和OrfV-F1L基因疫苗联合免疫小鼠的免疫应答研究

为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ和TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均显著高于pVAX1-F1L组,与pVAX1组、PBS组相比差异极显著(P<0.01);pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10细胞因子水平均显著高于pVAX1组和PBS组,与pVAX1-F1L组相比差异不显著(P>0.05);且pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-F1L组、pVAX1组和PBS组(P<0.01)。结果表明,pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠,能诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫,pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能促进Th1型细胞因子的分泌。

抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

制备抗羊口疮病毒118(ORFV118)重组蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性。构建ORFV118原核表达重组质粒pET33b-ORFV118,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,诱导表达出ORFV118重组蛋白;利用Ni-NTA亲和层析法纯化ORFV118重组蛋白;以纯化蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体;利用间接ELISA法、Western blot、免疫组化等方法分别对单抗特异性、效价、亚型以及ORFV118蛋白的功能进行研究。获得了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为1A2,3B5,5D10,它们诱生的小鼠腹水效价分别为110 000,16 400,18 000。其中效价最高的1A2抗体亚型为IgG1,能特异性结合其免疫原蛋白、真核表达产物以及病羊皮肤组织中的ORFV118蛋白。免疫组化结果显示单抗1A2染色局限于皮肤表皮层角化细胞及浸润至皮下组织的炎症细胞,与病毒侵染上皮组织层的特性相符。制备的单抗1A2能特异性识别ORFV118。深入研究单抗1A2将为了解ORFV118的生物学特性,为羊传染性脓疱病的诊断、预防与治疗提供可能和新思路。

羊传染性脓疱病毒口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白基因差异分析及原核表达

[目的]克隆羊传染性脓疱病毒(ORFV)口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白(CBP)基因并进行生物信息学分析及原核表达,为后续研究CBP基因在ORFV免疫逃逸机制中的作用提供基础数据。[方法]以患病羔羊口唇结痂和小肠提取的DNA为模板设计特异性引物,进行PCR扩增并克隆测序,对表达的CBP基因遗传进化关系及蛋白理化性质、结构特点进行分析;利用原核表达系统pGEX-4T-1构建重组质粒pGEX-4T-1-CBP-K、pGEX-4T-1-CBP-N并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blotting对蛋白进行抗原性分析。[结果]经测序,ORFV口唇感染株CBP基因全长873 bp,内脏感染株CBP基因全长846 bp,且后者在第217 bp处有24 bp碱基的丢失。系统进化树显示,口唇与内脏感染株不属于同一进化分支,遗传距离较远;口唇感染株CBP基因与中国吉林分离株亲缘关系最近;内脏感染株CBP基因与马来西亚分离株亲缘关系最近。口唇感染株CBP基因编码291个氨基酸,内脏感染株CBP基因编码282个氨基酸,蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构有5处差异,主要是α-螺旋和β-折叠的变化。试验成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中以包涵体形式表达CBP融合蛋白,分子质量约为60 ku。[结论]本研究内脏感染株与口唇感染株相比,存在24 bp的缺失,并成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,可在大肠杆菌中表达CBP融合蛋白。本研究结果为揭示CBP在ORFV与宿主互作中发挥的作用提供参考,也可为寻找新的羊传染性脓疱防治方法提供依据。

表达ORFV F1L基因的重组山羊痘病毒的构建及初步鉴定

目的:研制安全有效的预防羊口疮的重组山羊痘病毒活载体疫苗。方法:采用PCR技术扩增ORFV的F1L基因,将其与载体pUC-TK12连接,同时酶切插入LacZ报告基因和Pb56双向启动子,构建重组转移载体pUC-TK12-LacZ-F1L,将其转染至已感染山羊痘病毒疫苗株的BHK-21细胞,进行同源重组。通过蓝白斑筛选,收获重组病毒并进行PCR初步鉴定。结果:获得了全长为1 023bp的F1L基因,测序结果与GenBank公布的标准序列同源性为99.9%。构建了重组转移载体pTL-F1L,转染BHK-21细胞后,获得了重组山羊痘病毒蓝色蚀斑。结论:该研究成功获得了含有羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒疫苗候选株rGPV-F1L,为羊传染性脓疱病基因工程活载体疫苗的研制奠定基础。

羊口疮病毒ORFV129蛋白对树突状细胞成熟和功能的影响

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P<0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P<0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。

羊痘病毒与羊口疮病毒双重RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测方法。【方法】选取CaPV P32基因及ORFV 011基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV RPA引物各3对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各1条;进行单重基础RPA引物筛选试验;对双重RPA-LFD的反应时间及反应温度进行优化;探索双重RPA-LFD最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重RPA-LFD灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的55份临床样品进行检测。【结果】引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为39℃、反应时间为11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的最佳引物配比为0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为0.1 μL∶0.9 μL;双重RPA-LFD灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×10~0 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示RPA-LFD检测阳性率与PCR检测阳性率相符合。【结论】成功建立了CaPV与ORFV双重RPA-LFD快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断。