利用CRISPR-Cas9技术编辑OsBADH2基因改良优质恢复系桂恢852的香味品质

【目的】利用CRISPR-Cas9技术编辑桂恢852的甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2),以期快速改良广西优质恢复系桂恢852的香味品质,为广西香稻新种质的创制提供亲本资源及技术参考。【方法】以广西优质非香型水稻桂恢852为材料,对其OsBADH2蛋白的序列特征、保守结构域、保守基序、系统发育进化等进行分析,再根据CRISPR-GE网站信息挑选合适的靶位点,分别构建OsBADH2基因第1、2外显子的双突载体pLM62和第7外显子的单突载体pLM63。利用CRISPR-Cas9技术和水稻遗传转化技术靶向敲除桂恢852的OsBADH2基因,获取不同类型的osbadh2突变体。以桂恢852为对照,通过咀嚼法鉴定突变体osbadh2是否具有香味。最后,通过农艺性状测定和单因素方差分析,判断OsBADH2基因突变是否影响农艺性状。【结果】OsBADH2基因序列全长为6268 bp,包含15个外显子和14个内含子,其编码区(CDS)为1512 bp,编码503个氨基酸残基,具有1个典型的Aldedh结构域(第16~485位氨基酸),属于醛脱氢酶,其蛋白序列与结构相对保守。通过OsBADH2氨基酸序列的BLAST比对分析,分别获得水稻的3个高相似性蛋白和拟南芥的4个高相似性蛋白,其中水稻OsBADH1、OsBADH2、OsALDH2B2、OsALDH2C1及拟南芥BADH1、BADH2、AL2C4均属于ALDH-SF(Aldehyde dehydrogenase superfamily)超家族成员。OsBADH2与OsBADH1为旁系同源基因,与拟南芥中BADH1和BADH2为直系同源基因。在桂恢852的遗传背景下成功获得4种突变类型且不含T-DNA的纯合突变体株系(osbadh2-1~osbadh2-4)。这4种突变类型均会使OsBADH2基因发生移码突变,导致翻译过程提前终止,破坏OsBADH2蛋白的原有结构和功能,导致4个osbadh2突变体株系的稻米产生香气。4个osbadh2突变体株系的株高、有效穗数、穗长、结实率、千粒重、长宽比与桂恢852野生型间无显著差异(P>0.05),但osbadh2-2突变体与osbadh2-4突变体的结实率存在极显著差异(P<0.01)。【结论】桂恢852的4个osbadh2突变体株系均具有香味品质,且综合农艺性状与野生型无显著差异,表明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能快速定向改变水稻品种的目标性状,极大缩短了育种年限。

香稻品种OsBADH2突变位点分析及其功能标记的开发

香稻拥有浓郁的香味和较高的营养价值,深得消费者的喜爱和育种专家的重视,挖掘和利用香稻基因资源为培育优质香稻品种奠定基础。水稻甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2)功能的丧失导致稻米具有香味。通过对10份香稻品种OsBADH2编码区进行测序分析,明确其变异类型。根据香稻OsBADH2第7外显子8 bp的缺失,设计功能标记E7,利用E7分别对测序的10份香稻品种和2个香稻/非香稻育种群体的OsBADH2基因型进行验证与检测。结果表明,象牙香占、花香B、农香24等9份香稻均在第7外显子发生8 bp的缺失和3 bp的替换,而香稻Xiao7在第14外显子有1个碱基(G)的插入突变。功能标记E7能快速准确地鉴定OsBADH2的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型。

稻香相关基因OsBADH2在“吉粳88”中的基因编辑研究

近年来稻米的香味品质受到消费市场的格外重视。水稻OsBADH2基因是影响稻米香味的重要基因,选择优质粳稻品种,针对该基因进行基因编辑,有望创制出香味品质优异的粳稻材料。本研究通过分析OsBADH2基因外显子序列的保守性,选择了3个特异性靶点,分别构建了U6启动子驱动的包含不同靶点的gRNA表达盒,并将其连入植物基因编辑表达载体。利用基因枪介导的瞬时转化体系,对非香型粳稻品种"吉粳88"进行遗传转化,T_0代共获得847株再生材料。经高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析和测序验证,24株T_0代材料的OsBADH2基因编辑靶点发生了不同类型的编辑。在T_1代材料中获得了7类不含转基因成分,且OsBADH2基因靶点纯合的基因编辑后代材料。本研究结果表明基于基因枪介导的瞬时转化体系,转化再生过程中省略了抗性筛选过程,并辅以高效的HRM检测,能够在T_1代即获得位点发生纯合编辑且无转基因成分的基因编辑后代材料。本研究获得的OsBADH2基因编辑的"吉粳88"后代材料也为培育香味品质改良的粳稻品种提供了新材料。

无选择标记基因的优质香稻新品系培育

香味是稻米食味品质的主要性状之一,为培育无抗性选择标记基因的优质香稻新品系,以携带有超双元载体OSBADH2-RNAi的农杆菌菌株EHA105介导,将OSBADH2基因的RNA干扰结构和潮霉素抗性选择标记(HPT)基因同时导入优质粳稻武育粳3号成熟胚来源的愈伤组织中,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得了54个独立转化子,其中36个转化子同时含目的基因和HPT基因,共转化频率为66.7%;从这些转化子的后代中共筛选获得25个去除HPT基因的转化子,去标记频率为69.4%;通过KOH法等4种方法进行香味的鉴定,获得15个具有香味的株系。实时定量PCR分析结果表明,具香味株系中的OSBADH2基因的表达受到了明显抑制,进一步证明了香味的产生是由于OSBADH2基因被干扰而引起。农艺性状调查表明,抑制OSBADH2基因的表达对水稻产量相关性状,包括株高、千粒质量、穗粒数和结实率影响不明显。