癌睾丸抗原OY-TES-1在脑胶质瘤中的表达及其抗体血清学分析

背景与目的:胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤,预后差,生存率低。近年来,以利用癌睾丸(cancer-testis,CT)抗原作为靶抗原行肿瘤免疫治疗已成为研究的热点,而OY-TES-1是CT抗原家族中的一员。本研究拟了解OY-TES-1在脑胶质瘤中的mRNA表达及其抗体出现情况,探讨将OY-TES-1应用于肿瘤免疫治疗及辅助诊断的可能性。方法:收集51例脑胶质瘤患者肿瘤组织标本及配套血清,107例健康人血清。通过RT-PCR,从mRNA水平研究OY-TES-1在脑胶质瘤组织中的表达;用酶联免疫吸附分析技术(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测患者及健康人血清OY-TES-1抗体;同时对OY-TES-1 mRNA的表达及血清抗体出现的临床意义做初步分析。结果:在脑胶质瘤患者中OY-TES-1 mRNA阳性率为80.4%(41/51),血清OY-TES-1抗体阳性率为15.7%(8/51),健康人血清则为阴性。OY-TES-1 mRNA的表达和血清抗体的出现均与脑胶质瘤患者的年龄、性别、病理分级、肿瘤大小等临床指标无关。结论:OY-TES-1在脑胶质瘤中存在较高的表达,并能引起部分患者的体液免疫反应,有望作为胶质瘤免疫治疗的靶抗原。

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。

癌-睾丸抗原OY-TES-1致敏的树突状细胞体外抗胶质瘤的免疫效应

目的研究负载癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)OY-TES-1的树突状细胞(dendritic cell,DC)体外抗胶质瘤的细胞免疫效应。方法细胞因子联合诱导HLA-A2+健康人外周血单核细胞为DC,采用OY-TES-1重组蛋白致敏DC,流式细胞术检测成熟DC表型分子;进而使DC诱导同体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),CCK8检测T细胞增殖情况,ELISPOT检测IFN-γ含量,乳酸脱氢酶释放法检测CTL对胶质瘤细胞U251和A172的杀伤作用。结果负载OY-TES-1的DC低表达CD14,而高表达CD1a、CD83和CD80表型分子,能明显促进CD8+T细胞的增殖及其IFN-γ的分泌(P<0.05);而OY-TES-1特异性CTL在效靶比为50∶1时对HLA-A2+和OY-TES-1+U251、HLA-A2-和OY-TES-1+A172均有明显杀伤作用(均P<0.05),但其对U251的杀伤作用更强。结论体外用OY-TES-1重组蛋白致敏的DC可诱导特异性抗胶质瘤免疫应答,提示OY-TES-1可能成为胶质瘤免疫治疗的靶点。

卵巢癌细胞中OY-TES-1基因启动子CpG位点甲基化状态分析

目的：了解卵巢癌SKOV3细胞中OY-TES-1启动子区域CpG位点的甲基化状态。方法：运用免疫细胞化学法检测SKOV3细胞中OY-TES-1蛋白表达；通过硫化测序PCR法，分析SKOV3细胞中OY-TES-1启动子区域CpG位点的甲基化状态，并与睾丸组织相比较。结果：免疫细胞化学法检测结果显示，SKOV3细胞中OY-TES-1蛋白呈阳性反应；在检测的OY-TES-1启动子区域（转录起始点-127bp-＋110bp，含24个CpG位点）中，CpG位点的甲基化频率为80．21％，其甲基化状态明显高于睾丸组织。结论：SKOV3细胞中OY-TES-1启动子CpG位点处于高甲基化状态，进一步可探讨甲基化抑制剂氮杂脱氧胞嘧啶对OY-TES-1甲基化状态及其表达水平的影响。

人肝细胞癌中OY-TES-1和PKM2的表达及调控关系初探

目的:探讨癌-睾丸抗原OY-TES-1和丙酮酸激酶M2型(PKM2)在人肝细胞癌(HCC)中的表达,并分析OY-TES-1对PKM2表达的影响。方法:利用LinkedOmics数据库筛选OY-TES-1表达正相关基因集;使用DAVID数据库对OY-TES-1进行功能富集分析,了解HCC中OY-TES-1潜在的生物学功能,寻找功能相关基因;通过GEPIA数据库分析和实时荧光定量PCR(qPCR)实验检测,探讨OY-TES-1和功能相关基因在HCC中的表达及临床意义;干扰HCC细胞株中OY-TES-1的表达,qPCR和Western blotting检测OY-TES-1功能相关基因的表达变化。结果:LinkedOmics数据库筛选获得1001个与OY-TES-1表达正相关的基因集;功能富集结果显示,OY-TES-1可能通过PKM2参与HCC细胞多糖合成、脂代谢、碳水化合物代谢等信号通路。GEPIA数据库分析显示,HCC组织中OY-TES-1和PKM2的表达显著高于正常肝组织,两者表达呈正相关关系(r=0.3;P<0.001);qRT-PCR证实OY-TES-1(癌组织:0.58±0.95 vs.癌旁组织:0.36±0.61,P<0.05)和PKM2(癌组织:0.14±0.17 vs.癌旁组织:0.08±0.14,P<0.05)在HCC组织中均为高表达,两者的表达呈正相关关系(r=0.482,P<0.001);尚未发现OY-TES-1和PKM2的表达与HCC患者临床参数相关。在HepG2和BEL-7404细胞株中干扰OY-TES-1表达,PKM2的mRNA和蛋白表达随之明显下调。结论:OY-TES-1和PKM2均高表达于HCC,且两者具有较强的表达相关性;HCC中OY-TES-1能够影响PKM2的表达。

OY-TES-1诱导的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖活化作用

目的通过癌-睾丸抗原OY-TES-1致敏树突状细胞(DC),研究其对T淋巴细胞的增殖活化作用。方法体外诱导培养人外周血DC,观察其细胞形态并经流式细胞仪进行表型鉴定;分别用OY-TES-1融合蛋白(OY-MBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)致敏DC,与T淋巴细胞共同培养。CCK-8法检测不同蛋白致敏DC后T淋巴细胞的增殖,ELISA检测致敏DC与T淋巴细胞共同培养后上清液IFN-γ的含量。结果诱导出高表达HLA-DR、CD86、CD83和CD80并具有典型细胞特征的DC。经不同蛋白致敏的DC均能促进T淋巴细胞的增殖活化,其中OY-MBP致敏的DC促进T淋巴细胞增殖的能力明显强于其他各组(P<0.05),IFN-γ分泌量也明显高于其他各组(P<0.05)。结论 DC在体外经OY-TES-1融合蛋白致敏后,可显著促进T淋巴细胞的增殖活化。

特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中OY-TES-1蛋白表达的抑制作用

目的:探讨特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中肿瘤-睾丸抗原OY-TES-1蛋白表达的影响。方法:针对OY-TES-1基因设计、化学方法合成的siRNA通过脂质体转染体外培养的卵巢癌SKOV3细胞,在转染后24、36、48、72 h,通过免疫细胞化学检测OY-TES-1蛋白的表达水平。结果:靶向OY-TES-1基因siRNA转染SKOV3细胞后,OY-TES-1蛋白的表达明显降低,其抑制作用在转染后24 h出现,转染后36 h几乎完全被抑制,转染后72 h开始出现RNAi衰减现象。结论:OY-TES-1特异性siRNA(1 486～1 504)序列可在体外有效地干扰SKOV3细胞中OY-TES-1基因的表达。

卵巢上皮性癌组织中SP17、SPAG9、OY-TES-1基因的去甲基化表达及其与临床病理的关系

目的检测在卵巢上皮性癌与非卵巢癌中,精子蛋白17（SP17）、精子相关抗原9（SPAG9）、OY-TES-1这三种癌-睾丸抗原基因启动子区域去甲基化表达的差异,探讨其与卵巢上皮性癌临床病理分期的关系。方法收集2015年1月至2016年4月25例新鲜的卵巢上皮性癌组织标本,及25例新鲜的非卵巢癌组织标本,采用DNA酸性亚硫酸盐转化、PCR扩增及甲基化敏感性内切酶方法检测SP17、SPAG9、OY-TES-1在卵巢上皮性癌与非卵巢癌中Cp G岛的去甲基化表达。结果与非卵巢癌组织比较,卵巢上皮性癌组织中SP17、SPAG9、OY-TES-1基因启动子区存在高去甲基化表达（P均〈0.01）。三种癌-睾丸抗原基因启动子区域去甲基化表达阳性率在卵巢上皮性癌不同年龄、组织学类型和分化程度中比较,差异无统计学意义（P均〉0.05）;SP17、SPAG9启动子区域去甲基化表达阳性率在有淋巴结转移者中高于无淋巴结转移者（P〈0.01,P〈0.05）,在Ⅲ-Ⅳ期患者中高于Ⅰ-Ⅱ期患者（P均〈0.05）;而OY-TES-1启动子区域去甲基化表达阳性率仅在有淋巴结转移者中高于无淋巴结转移者（P〈0.05）。结论 SP17、SPAG9、OY-TES-1基因启动子区域在卵巢上皮性癌中存在高去甲基化表达,且其去甲基化表达均与患者发病年龄、组织学类型、分化程度无关;部分与淋巴结转移、肿瘤分期相关。SP17、SPAG9、OY-TES-1或可成为卵巢上皮性癌免疫治疗的靶位点。