过表达Oct4B1诱导结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化

目的:探讨Oct4B1基因过表达是否诱导人结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化(EMT)及其可能的机制。方法:用带G418抗性的Oct4B1基因过表达质粒及阴性对照质粒转染人结直肠癌SW480细胞株,分别称为实验组(SW480-Oct4B1)及对照组(SW480-NC),转染成功后用G418筛选建立稳定转染的细胞株,对两种稳定转染细胞进行如下检测:(1)RTq PCR检测Oct4B1的mRNA水平;(2)划痕实验和Transwell小室实验检测迁移和侵袭能力;(3)Western blot检测EMT相关标记物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达;(4)RT-q PCR和Western blot检测EMT转录因子Twist的mRNA及蛋白表达。结果:稳定转染细胞株建立后,实验组与对照组比较:Oct4B1基因表达水平明显升高(P<0.01);细胞迁移明显增强(P<0.01);细胞侵袭能力明显提高(P<0.01);上皮标记物E-cadherin蛋白表达量明显下降(P<0.01);而间质标记物N-cadherin及Vimentin蛋白表达量明显上调(P<0.01);Twist的mRNA及蛋白表达量均明显升高(P<0.01)。结论:过表达Oct4B1基因可诱导人结直肠癌SW480细胞发生EMT,增强细胞迁移及侵袭能力,其分子机制可能与提高Twist表达有关。

Oct4B1在结直肠癌干细胞中的表达及意义

目的:探讨胚胎干细胞转录因子Oct4的亚型Oct4B1在结直肠癌干细胞中的表达及其可能的作用。方法:以结直肠癌细胞株SW480细胞采用悬浮培养法培养出的3D微球体及其亲本细胞SW480为研究对象,采用细胞分化实验、细胞软琼脂克隆实验、流式细胞技术检测干细胞标记物CD133、CD44的表达以验证3D微球体是否富集肿瘤干细胞(CSCs),实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测两种细胞Oct4B1 mRNA表达水平。结果:3D微球体具有分化为普通肿瘤细胞的能力,相对于亲本细胞,3D微球体体外克隆形成能力明显增强(P<0.01),干细胞标记物CD133、CD44明显高表达(P<0.01),Oct4B1 mRNA表达水平明显增高(P<0.01)。结论:干细胞调控因子Oct4的亚型Oct4B1在富集结直肠癌CSCs的3D微球体中表达明显增高,其可能参与结直肠癌CSCs的调控。

miR-299-3p靶向OCT4B1调控结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭及凋亡

目的探讨miR-299-3p靶向调控OCT4B1对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用。方法将SW480细胞分为NC组、mimics组、inhibitor组,采用MTT法检测细胞活力,结晶紫染色检测单克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR测定细胞miR-299-3p和OCT4B1 mRNA,蛋白免疫印迹法测定OCT4B1蛋白表达。荧光素酶报告基因检测miR-556-3p对SW480细胞OCT4B1活性的调控作用。结果与NC组比较,miR-299-3p水平、细胞凋亡率mimics组升高,inhibitor组降低,且mimics组高于inhibitor组(P<0.05);OCT4B1 mRNA和蛋白水平、细胞穿膜数、细胞存活率、单克隆形成数mimics组降低,inhibitor组升高,且mimics组低于inhibitor组(P<0.05)。结论miR-299-3p过表达可抑制结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡,可能与miR-299-3p抑制OCT4B1 mRNA和蛋白表达有关。

Oct4B1基因过表达增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂的耐药性及其机制

目的 探讨Oct4B1基因过表达是否增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂耐药性及其机制,以及与诱导细胞上皮-间充质转化（EMT）过程的关系.方法 实验分组：将SW620细胞随机平均分为实验组及对照组、实验组（SW620-Oct4B1）：转染带G418抗性的Oct4B1过表达质粒;对照组（SW620-NC）：转染带G418抗性的阴性对照质粒;筛选合适浓度G418建立稳定转染细胞株.对稳定转染两组细胞作如下检测：（1）噻唑蓝（MTT）法检测细胞对不同浓度奥沙利铂的敏感性;（2）Western blot检测P-糖蛋白（P-gp）及EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达;（3）划痕实验检测12、24 h迁移能力;（4）Transwell小室检测24 h时侵袭能力.结果 实验组与对照组比较：（1）对奥沙利铂敏感性实验组明显低于对照组（t =8.889、5.427、9.678、4.459、5.362,P=0.001、0.006、0.001、0.011、0.006）;（2）P-gp表达两组分别为0.401、0.439、0.419（0.420±0.020）及0.099、0.110、0.120（0.110 ±0.010）,实验组明显高于对照组（t=24.723,P=0.000）;（3）12 h伤痕愈合率分别为32.196％、32.382％、33.441％ （32.670 ±0.670）％及23.049％、25.286％、23.674％ （24.000±1.150）％,实验组明显高于对照组（f=11.245,P=0.001）;24 h伤痕愈合率分别为67.048％、68.650％、66.291％ （67.330±1.200）％和49.161％、47.632％、53.203％（50.000 ±2.880）％.实验组显著高于对照组（t=9.620,P=0.001）;（4）24 h两组透膜细胞数分别为400.105、407.500、384.300（397.300±11.850）个及205.641、186.244、215.02（202.300±14.680）个,实验组显著多于对照组（t=17.905,P=0.000）;（5）E-cadherin表达两组分别为0.186、0.190、0.223（0.200 ±0.020）及0.530、0.531、0.529（0.530 ±0.010）,实验组明显低于对照组（t=28.143,P=0.000）,而N-cadherin表达两组分别为0.949、0.935、0.906（0.930±0.020）及0.687、0.648、0.675（0.670±0.020）,实验组显著高于对照组（t=15.181,P=0.000）.结论 Oct4B1基因过表达能增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂耐药性,其机制可能与诱导细胞EMT过程有关.

沉默Oct4B1基因对结直肠癌耐药细胞上皮间质转化逆转实验研究

目的研究已证实Oct4基因可调控肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。本研究探讨沉默Oct4的亚型Oct4B1能否逆转结直肠癌耐奥沙利铂细胞株SW620/OxR的EMT。方法分别采用带G418抗性的Oct4B1-shRNA质粒和阴性对照质粒转染SW620/OxR细胞,转染成功后通过G418筛选建立稳定转染细胞株,分别称为实验组(RNAi组)及对照组(Ctrl组)。对两组细胞作如下检测,(1)RT-qPCR检测Oct4B1的mRNA水平;(2)划痕实验检测细胞迁移能力;(3)Transwell小室检测细胞侵袭能力变化;(4)蛋白质印迹法检测EMT标记物E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平。结果RNAi组与Ctrl组比较,(1)Oct4B1mRNA表达明显下调,P<0.05;(2)细胞迁移能力明显减弱,P<0.05;(3)细胞侵袭能力显著降低,P<0.01;(4)上皮标记物E-cadherin明显增高(P<0.05),间质标记物N-cadherin(P<0.01)和Vimentin(P<0.05)则明显下调。结论沉默Oct4B1基因可逆转SW620/OxR细胞EMT。