白菜OguCMS相关MYB家族新基因BcMYBogu的克隆与特征分析

为研究CMS核质互作的分子机理,将甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和白菜(B.campestris L.ssp.chinensis Makino)杂交并连续回交6代获得白菜OguCMS,在与保持系花药细胞学比较的基础上,运用cDNA-AFLP筛选得到白菜OguCMS早、中期花蕾提早表达的MYB-like差异片段,利用RACE克隆得到该片段的cDNA全长,命名为BcMYBogu(GenBank登录号:EF127861),对其氨基酸序列和表达特征进行研究。结果表明,白菜OguCMS绒毡层在四分体后增生,高度液泡化,导致小孢子花粉外壁异常,细胞质同外壁分离并降解;花药变白;BcMYBogu具有典型的MYBDNA结合域—W残基和SH[AL]QKY[RF]基序;系统进化分析显示BcMYBogu与AtMYB26,AtMYB32和AtMYB4等聚类在同一分枝;RT-PCR分析表明BcMYBogu在莲座叶、花茎和花蕾中均有表达,但在OguCMS花蕾中表达量显著上升。由此推测BcMYBogu是一个新的与白菜OguCMS相关的MYB家族新成员。

油菜OguCMS与诸葛菜属间杂种的获得

采用子房培养方法 ,获得了油菜OguCMS与诸葛菜属间杂种 .授粉 7～ 2 7d的子房在附加不同激素组合的MS培养基上培养 .两个多月后 ,从一种培养基上裂开的成熟子房中长出胚性芽 .此芽在附加 6 BA 2mg/L和NAA 0 .2mg/L的MS培养基上快繁 .经鉴定 ,此苗的染色体数为 2n =3 1 ,该属间杂种获得率为 0 .0 0 72 % .杂种苗经生根培养后 ,移入试验田 ,进行了形态学观察 .

低温胁迫对3个小白菜OguCMS与保持系生化指标的影响

以3个小白菜OguCMS与保持系为试材,苗期进行低温处理,对其叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化进行研究。结果表明:不育系的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量在处理的各阶段均低于其保持系,SOD、POD和CAT活性则是不育系高于其保持系。随着低温处理时间的延长,不育系和保持系叶绿素和可溶性蛋白质含量一直下降,可溶性糖和脯氨酸含量呈现先上升后下降的趋势;SOD、POD和CAT活性呈现先上升后下降的趋势。不育系和保持系在处理的各个阶段变化的一致性和处理后各生化指标数值差异缩小,表明小白菜OguCMS在苗期遇低温的抗逆能力与保持系很接近。

白菜型油菜Ogucms的花器形态研究

将白菜型油菜Ogucms的花器和其相应的保持系、白菜型油菜细胞质雄性不育系533A的花器形态进行比较研究,结果表明萝卜细胞质雄性不育系的花瓣平展不皱缩,面积和相应的保持系比较,占70%—90%;四强雄蕊相对雌蕊花柱的位置在2/3—3/4;花粉彻底败育,无花粉。而533A花瓣皱缩,面积只占相应保持系的50%—60%,四强雄蕊相对雌蕊花柱的位置在1/3—1/2;花粉败育不彻底,有微量花粉。

Ogucms在白菜型油菜上的形态表现

观察转育成功的白菜型油菜Ogucms苗期幼苗颜色及生长势、花期花器的形态表现,调查成熟期结实性,并与相应的保持系进行比较。结果表明,各不育系苗期表现和相应的保持系无差异；花期Ogucms的花瓣平展不皱缩,面积和相应的保持系比较占70％～90％；四强雄蕊位居雌蕊花柱的2/3～3/4处；雄蕊花粉彻底败育,无微量花粉；成熟期结实率和相应的保持系差异不显著。

Ogucms结球白菜雄性不育系研究

对Ｏｇｕｃｍｓ结球白菜雄性不育系花器构造和花药发育细胞学的系统研究结果表明，Ｏｇｕｃｍｓ３４１１－７雄蕊完全花瓣化；花药发育受阻于四分体到单核花粉形成之间，同时，伴随有花药形状畸变，药室位置不固定，药隔维管束发育不健全，中层细胞不退化，绒毡层细胞明显肥大等异常现象。

甘蓝OguCMS育性相关转录因子BoMYB1的转录激活功能分析

OguCMS是甘蓝中应用最为广泛的雄性不育类型,前期表达谱分析表明转录因子BoMYB1在OguCMS花药中表达下调达10.3倍。通过构建酵母双杂交转录因子BD区诱饵载体pGBKT7-BoMYB1,将其转入酵母菌AH109中进行转录因子BoMYB1转录激活功能的分析。结果显示,AH109[pGBKT7-BoMYB1]在SD/-Trp/x-a-gal、SD/-Ade/-Trp/x-a-gal、SD/-His/-Trp/x-a-gal平板上均长出蓝色菌落,表明BoMYB1可以自主激活报告基因ADE2、HIS3和MEL1,说明转录因子BoMYB1具有转录自激活功能。研究结果对于深入探索该基因的功能及阐明OguCMS花药败育的机理具有重要意义。

甘蓝OguCMS相关的花药优势表达转录因子BoBHLH1的克隆与表达分析

以甘蓝OguCMS花药中下调表达的EST序列为信息探针,克隆到一个与甘蓝OguCMS相关的bHLH家族转录因子,命名为BoBHLH1(GenBank登录号:GU390530),该基因编码102个氨基酸,具有典型的bHLH结构域,可识别顺式元件G-box序列,预测该蛋白定位在线粒体上。荧光定量RT-PCR表明,BoBHLH1是一个甘蓝花药中优势表达的基因,且在花药发育的早期和晚期均有一个表达高峰。研究结果为下一步分析其在甘蓝花药发育过程中的功能验证及OguCMS核质互作机理奠定了基础。

利用分子标记辅助选择选育抗根肿病甘蓝型油菜OguCMS育性恢复材料

为了选育出具有抗根肿病4号生理小种的甘蓝型油菜OguCMS恢复系,本研究以‘华抗5号’为供体,以甘蓝型萝卜质(OguCMS)恢复系RF04为受体亲本杂交,然后与RF04进行回交,构建培育新型恢复系选择群体,利用与萝卜质(OguCMS)恢复基因、抗根肿病基因紧密连锁的特异引物标记进行筛选,筛选出20个优良株系。通过实验室接种鉴定发现,RF04 100%感病且发病等级都为3级,而‘华抗5号’及F1代表现出100%抗病,发病等级为0级,说明F1代已经有抗病基因位点PbBa8.1;利用PbBa8.1基因紧密联锁标记(cnu_m090a, sau_um353a, A08-300)鉴定发现,BC2F2群体中均含有目标扩增片段,进一步说明基因片段PbBa8.1已转入回交群体;通过田间抗性鉴定,最终选择出2份株系在不同地点均表型高抗病,为C21906271-1和C21906145-1;1份材料(C21906273-2)在武汉表现出高抗病,在安徽表型抗病。本研究为利用分子标记辅助选择技术培育具有抗根肿病基因的甘蓝型春油菜提供了理论基础和技术途径。

油菜萝卜胞质雄性不育系与诸葛菜属间杂种回交一代(BC_1)的快速繁殖及生根

将油菜OguCMS与诸葛菜属间杂种回交一代 (BC1) ,在MS附加不同激素浓度的基本培养基上诱导丛生芽 结果发现 ,MS +1.5mg/L 6 BA +0 .15mg/LNAA对诱导丛生芽有较好的效果 ,丛生芽增殖系数可达 3.2 .小芽生根培养基以MS +0 .

甘蓝型油菜Ogu CMS恢复材料1575R的分子初步鉴定

对甘蓝型油菜萝卜质不育系(Ogu CMS)13个恢复材料(1575R)进行Ogu CMS恢复基因Rfo及其旁侧特异性标记分子水平鉴定,为鉴定有别于国外恢复系提供依据。用Rfo特异性分子标记、5个Rfo连锁的特异性分子标记、具有缩短的萝卜片段的芸薹属Ogura恢复系(SRF系)特异性标记对1575R的13个恢复材料进行检测,检测以甘蓝型油菜Ogu CMS的4个不育材料和4个保持材料为对照,检测结果与国外同类的恢复材料RRH1、R113、R2000、SRF系和NW1717做比较鉴定。1575R的13个恢复材料都含有Ogu CMS的恢复基因Rfo,而缺少了RRH1、R113、R2000共有的标记Bol Jon。同时,1575R含有和NW1717相同的标记。由此初步鉴定出1575R可能和RRH1、R113、R2000、SRF系是不同的,而和NW1717的同源性最近。

油菜OguC MS与诸葛菜属间杂种F_1的快速繁殖

作者通过摸索建立了适宜于油菜OguCMS与诸葛菜属间杂种F1的快速繁殖方法 .发现MS+ 6 BA 1.0mg/L +NAA 0 .1mg/L适宜于诱导丛芽 ,丛芽增殖系数高达 3.5 ;MS +NAA 0 .1mg/L适宜于诱导生根 .

一种紫色大白菜细胞质不育系的分子鉴定

为了获得紫色大白菜细胞质不育系的特异序列,鉴定该不育系所属的不育类型,应用设计的orf138上、下游引物PCR扩增6份材料:紫色大白菜CMS不育系,保持系07-721,杂交F1,3个回交BC1单株BC1-1、BC1-2和BC1-3。对获得的差异片段进行克隆、测序,同源性比较。结果表明,在紫色大白菜CMS不育系、杂交F1、3个回交BC1单株上均扩增到309 bp的特异产物,而保持系07-721没有扩增产物。测序和同源性比对结果表明,紫色大白菜CMS的orf138与萝卜Ogura不育系的orf138、芸薹属作物与萝卜Ogu CMS体细胞杂种的orf138同源性均达到99%,E值为2e-155。证明了紫色大白菜CMS不育系为一种改良的Ogura萝卜细胞质不育系,同时初步探讨了该不育系和紫色基因的应用前景。

甘蓝Ogura细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

通过TAIL-PCR染色体步移技术,从甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)基因组中克隆到胞质雄性不育(OguCMS)相关基因BoMF1翻译起始位点上游521bp的启动子序列。软件分析预测表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB结合位点、植物激素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1转录起始位点上游521bp序列,将其置换pBI121中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121空载体作为阳性对照,通过农杆菌(LBA4404)介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1启动子序列能驱动GUS基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。