Oka株水痘病毒的生物学特性研究

将日本大阪大学微生物病研究会 (BIKEN)提供的Oka水痘病毒第 2 8代减毒株 ,通过MRC - 5人二倍体细胞连续传递 10代 ,建立主代及工作代毒种批 ,并对其后的 32代 ,34代 ,36代及 38代病毒按WHO规程进行全面检定 ,证实其生物学特性相似 ,免疫原性良好 。

水痘-带状疱疹病毒Oka株和84-7株基因特征的分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株和84-7株的部分基因特征进行分析,为建立Oka株和84-7株的鉴别方法提供依据。方法利用PCR技术扩增相关基因,并运用生物信息学软件对水痘-带状疱疹病毒OKa株和84-7株的Pst I酶切位点、抗原蛋白基因序列(ORF14,ORF68)、高突变区域(ORF62)及84-7株复制起点进行序列比较和分析。结果 Oka株酶切位点特征为Pst I-Sma I^+Bss HII^+Nae I^+,84-7株的酶切位点特征为Pst I^+Sma I^-Bss HII^-Nae I^-;Oka株和84-7株ORF14编码的蛋白质同源性为99.8%,3个碱基的差异导致了3个氨基酸的变化,且这两株病毒株的R2可变区的串联重复单位拷贝数均为7;Oka株和84-7株ORF68编码的蛋白质同源性为100%,且存在2个低复杂性区域(LCR);ORF62编码区蛋白质的同源性为99.2%,具有14个低复杂性区域;84-7株复制起点区域包含一个13TA+19GA结构。结论 Oka株和84-7株的同源性很高,但在酶切位点方面存在差异,可用于Oka株和84-7株的鉴别,为今后确立水痘-带状疱疹病毒毒株的鉴别方法提供依据。

二代测序法深度分析水痘疫苗Oka株病毒基因特征

采用二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术,对上海生物制品研究所有限责任公司(简称SIBP)2015—2017这3个年度生产的Oka株水痘疫苗进行深度测序,从分子水平分析疫苗质量的一致性,并与不同厂家疫苗/毒种进行比较,分析它们之间的遗传特征相关性。结果显示,3个年度生产的水痘疫苗中平均有77个位点的疫苗型位点检出频率(proportion of vaccine-type allele,Pv)≥10%,至少在两批疫苗中出现Pv≥10%的位点数共76个,两两之间Pv最大差值<10%,与平均值的最大差值为<5%。共有40个位点的Pv均值≥30%,其中19个位点导致氨基酸残基变异;15个位于ORF62区域。筛选出35个位点,比较5个公司水痘疫苗/毒种的Oka株病毒基因序列,结果显示它们之间存在相关性,同时存在一定的差异。研究表明,SIBP不同年度生产的水痘疫苗Oka株病毒具有良好的分子水平上的一致性,为疫苗质量管理与市场监督提供了方法和基础数据。

水痘减毒活疫苗的研究进展

水痘是由水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的一种高传染性疾病。接种疫苗是预防和控制VZV流行的最有效手段。美国从1995年开始实施儿童接种水痘疫苗的政策,显著降低了水痘相关疾病的发病率和病死率。近年来,水痘疫苗在我国应用越来越广泛。本文就水痘减毒活疫苗Oka株的研发,疫苗的有效性、安全性,病毒减毒的分子生物学特征和免疫策略等方面进行综述,以期能更全面地认识水痘减毒疫苗在预防和控制VZV传播方面所起的作用。

一株临床分离的水痘带状疱疹病毒的生物学特性分析

目的研究水痘带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV)临床分离株WXL株的生物学特性。方法筛选2BS细胞培养WXL株的最佳条件,对最佳培养条件下WXL株的滴度及糖蛋白E(glycoprotein E,g E)浓度进行检测,并检测所致细胞病变(cytopathic effect,CPE)直径,检测结果与Oka株进行比较。采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)对WXL株进行病毒颗粒形态观察;通过检测其ORF22基因片段的核酸序列,对其进行基因型分型。结果采用MOI 0.001感染2BS细胞培养WXL株时,其病毒培养液滴度最高。在此培养条件下,WXL株病毒培养液的滴度与Oka株无明显区别,但其g E浓度明显低于Oka株,同时CPE直径明显大于Oka株。WXL株病毒颗粒TEM观察到3种不同的病毒颗粒,其中,完整病毒颗粒直径约200 nm,核衣壳直径约100 nm,并呈六面体形;根据ORF22核酸序列检测结果,WXL株属于基因2型。结论 WXL株具有典型VZV野生毒株的生物学特性。

Oka株水痘减毒活疫苗流行病学保护效果Meta分析

目的评价Oka株水痘减毒活疫苗(Oka Strain Varicella Attenuated Live Vaccine,VarV)的保护效果。方法电子检索《美国国立生物信息中心数据库》、《中国生物医学文献数据库》、《中国期刊全文数据库》、《万方全文数据库》,将有关接种1剂Oka株VarV保护效果的研究纳入分析。使用RevMan4.2.10软件进行统计分析。结果共纳入15篇文献,8项研究为随机对照试验(Randomized Controlled Trial,RCT)/半(Semi)RCT(sRCT),7项为应急免疫后效果观察。Oka株VarV总体保护率为73%[95%可信区间(Confidence Interval,CI)为51%～85%],RCT/sRCT设计保护率为87%(95%CI:55%～96%),应急免疫保护率为46%(95%CI:16%～65%)。结论 Oka株VarV具有良好的保护效果。

水痘减毒活疫苗Oka株的传代稳定性

目的观察水痘减毒活疫苗Oka株(V-Oka)的传代稳定性。方法将V-Oka病毒在人二倍体细胞MRC-5上连续传代至50代,观察病毒的培养特性。选择32、34、38、42、46、50代病毒进行病毒滴度测定和鉴别试验,提取病毒DNA,对V-Oka的主要基因(ORF31、ORF62、ORF68、R区)进行PCR扩增和测序,并对序列进行分析。结果 V-Oka连续传代至50代,其培养特性、细胞病变一致,病毒滴度为5.0～5.6LgPFU/ml。与GenBank中登录的V-Oka序列比较,32～50代的V-OkaORF31、ORF62、ORF68、R区序列稳定,并趋于减毒型。结论 V-Oka传代至50代,生物学和分子遗传学特性稳定。

水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型别分析以及与Oka疫苗株的区别

目的运用分子牛物学方法对从水痘或带状疱疹患者皮肤疱疹液巾分离得到的水痘．带状疱疹（VZV）株进行基因型研究，并区分感染是由野生株还足由Oka疫苗株引起的。方法从水痘或带状疱疹患者的皮肤水疱液中分离VZV，然后利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析对病毒株的ORF38、54、62和R5可变区基因进行分析。结果在所分离的19株VZV中，存在PstⅠ^＋BglⅠ^＋R5A和PstⅠ^＋BglⅠ^＋RSB两种基因型，其中PstⅠ^＋BglⅠ^＋R5A占52．7％，PstⅠ^＋BglⅠ^＋RSB占47．3％，没有发现与Oka疫苗株相同的基因型。结论本研究中所分离的VZV毒株均系野生株，它们的基因型与欧洲、美国、日本的VZV分离株均不相同。利用病毒基因组中ORF38和ORF62区域的单一核苷酸多态性，能够区分疫苗株和野毒株。

水痘减毒活疫苗Oka株的分子生物学特性 免疫原性及安全性

水痘是由水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的一种高传染性的呼吸道疾病。目前预防接种是控制感染唯一的有效手段。现在使用的是Oka株水痘减毒活疫苗,疫苗Oka株独特的分子生物学活性可能与减毒作用相关。健康和免疫系统受损的个体,在接种Oka株水痘减毒活疫苗后都能产生特异性的体液和细胞介导的免疫应答,并能预防水痘的发生。30余年的临床应用表明该疫苗是安全有效的。

水痘疫苗生产工艺变更前后Oka株病毒基因序列及疫苗质量分析

目的 通过对采用细胞工厂工艺进行细胞培养前后的Oka株病毒基因序列和水痘疫苗质量进行分析比较，评价生产工艺变更对水痘疫苗质量的影响。方法 从水痘疫苗原液提取病毒基因组，采用PCR法扩增片段，通过对PCR产物测序或克隆质粒测序并拼接，获得Oka株的病毒全基因序列，并与GenBank中相关序列比对。对工艺变更前后生产的疫苗进行病毒滴度、牛血清白蛋白残留量和抗生素残留量比较。结果 工艺变更前后的疫苗病毒基因序列一致，检测到33个单核苷酸多态性位点为亲本型和疫苗型碱基共存，具有典型的Oka株特征，没有GenBank或文献报道的新突变。工艺变更前后生产疫苗的平均病毒滴度分别为5.00和5.02 lg蚀斑形成单位/ml，两者间的差异无统计学意义（t＝1.1，P＝0.26），且各项关键指标均符合企业标准和药典要求。结论 将细胞工厂引入生产工艺后，水痘疫苗具有与原工艺生产的制品相似的安全性和质量一致性。

水痘-带状疱疹病毒Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性及基因序列差异位点分析

目的研究水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性,并对不同代次毒株进行全基因测序及差异位点分析。方法将VZV Oka株在SV-1细胞株上连续传至48代,检测病毒滴度。对VZV Oka株33、35、38、39及48代病毒进行全基因测序,应用DNASTAR.Lasergene.v 7.1软件进行数据的拼接及序列分析。结果 VZV Oka株在SV-1细胞上连续传代获得的33~48代病毒滴度在4.000~4.625 lg CCID50/ml之间,病毒滴度的算数平均值为4.292 lg CCID50/ml;VZV Oka株基因组全长125 114 bp,GC含量46%;33、35、38、39、48代病毒的核苷酸序列同源性为99.99%,这5代病毒与标准疫苗株V-Oka的核苷酸序列同源性为99.96%;VZV Oka株在MRC-5、SV-1细胞上制备的38代病毒全基因序列有1个差异位点;本研究中的各代次病毒基因序列高度同源,与Varivax和Varilrix疫苗株、野毒株Dumas及亲本株p-Oka相比,与疫苗株V-Oka的同源性最高。结论 VZV Oka株在SV-1细胞上的适应性及遗传稳定性均良好。

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。

生产场地变更对水痘减毒活疫苗质量的影响

目的评价生产场地变更对水痘减毒活疫苗质量的影响。方法采用新一代基因测序技术(next-generation sequencing,NGS)。将生产场地变更前后的水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株毒种(VW-前、SYVW-后)与水痘减毒活疫苗原液(P-前、YZP-后)经DNA抽提、纯化、建库和测序,并对测序结果进行质量评价。以GenBank中登录的Dumas株基因序列(NC_001348)作为位置参考基因组,将生产场地变更前后4个样品全基因序列进行对比,从突变位点、碱基组成及突变频率(variant allele frequency,VAF),评价生产场地变更前后样品的一致性。结果4个样品的测序深度均>1500×,毒种及疫苗原液GC含量均约46%,测序质量较高。生产场地变更前后毒种及疫苗原液的突变位点和碱基组成一致,且VAF接近,4个样品两两比较,均呈高度相关(R^(2)均≥0.990,P均<0.001)。结论经NGS检测,工艺变更对水痘减毒活疫苗质量无影响。

水痘疫苗原液生产工艺改进

目的: 对现有水痘减毒活疫苗原液生产工艺进行改进,提高水痘疫苗原液产量及疫苗质量。方法: 2BS细胞传代至方瓶37代细胞,感染Oka株水痘-带状疱疹病毒工作种子批,35℃培养24h换病毒培养液(II)继续置35℃培养24h,取出使用Earle’s液洗涤方瓶细胞表面,当细胞病变达70%以上时,按120-360ml/瓶进行收获,置-65℃以下保存。经检定合格后进行合并、冻干制备水痘减毒活疫苗。结果: 使用此方法进行生产的水痘疫苗比较原工艺生产的水痘疫苗原液收获量大幅提升,并且疫苗的牛血清残留量与抗生素残留量则大幅下降,且各项检定指标全部合格。结论: 使用此方法生产水痘疫苗产量及质量比较原工艺有大幅度提升。