布鲁氏菌外膜蛋白OMP25和OMP31免疫学研究进展

布鲁氏菌病会导致家畜流产、不育等,严重损害养殖户的经济效益,同时对人类健康也产生威胁。近年布鲁氏菌病的频繁暴发对公共安全造成了巨大的威胁,因此,寻找更有效的方法来检测、预防布鲁氏菌病是关键。布鲁氏菌的外膜蛋白与布病的发病机制密切相关,其中OMP25和OMP31是布鲁氏菌的主要外膜蛋白,也是布鲁氏菌的重要毒力因子。目前,已有研究采用OMP25和OMP31评估布鲁氏菌的感染状况,并成功制造了重组外膜蛋白。本文回顾国内外学者对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25和OMP31免疫学研究现状和进展,旨在为布鲁氏菌的检测和疫苗开发提供理论支持。

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。

流产布鲁氏菌omp25基因毕赤酵母表达载体的构建和鉴定

目的构建流产布鲁氏菌omp25基因毕赤酵母分泌型表达载体。方法根据目的基因序列分析结果和毕赤酵母对密码子的优先选择性,选择了抗原性较强的长471bp的基因片段进行克隆和构建流产布鲁氏菌omp25基因毕赤酵母分泌型表达载体,并予鉴定。结果鉴定结果表明目的基因片段与发表的序列完全一致并正确地插入到酵母表达载体pPIC9Kα因子分泌信号肽下游。结论成功地构建了流产布鲁氏菌omp25基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-omp25。

布鲁氏菌Omp25的表达及抗原性分析

克隆羊外膜蛋白Omp25基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对Omp25蛋白的抗原性进行分析。以布鲁氏菌染色体DNA模板,扩增Omp25基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠杆菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blotting鉴定Omp25蛋白的免疫原性。将Omp25克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠杆菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 000的融合蛋白。Western blotting分析表明,所表达的蛋白具有免疫原性。结果表明,成功地表达并纯化了Omp25蛋白,而且纯化的蛋白具有一定的免疫原性。本试验为进一步研究Omp25蛋白的功能以及寻找布鲁氏菌的诊断性蛋白奠定了基础。

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组,得Omp25基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,经双酶切和DNA测序测定,将构建的重组质粒转化大肠杆菌(E.coliHB101,TOP10),经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白rOmp25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-Omp25,经IPTG诱导,特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段,并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。

布鲁氏菌OMP25与OMP31蛋白的表达及其间接ELISA诊断试剂盒研制

目的为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法。方法本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测。结果纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测。结论研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测。

新疆绵羊种布鲁氏菌OMP25基因的分子克隆及核苷酸序列的测定

根据GeneBank库上国际标准菌株绵羊种布鲁氏菌(63/290)的OMP25的基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)技术从新疆绵羊种布鲁氏菌(80/019)基因组DNA中扩增出OMP25基因片段,T4DNA连接酶将其连接于PBS-T克隆载体质粒上,将重组质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,结果成功克隆OMP25基因片段,进行核苷酸序列测定,测序结果分析表明:新疆绵羊菌株与国际标准菌株有明显差异。

新疆地区绵羊布鲁氏菌omp25基因PCR扩增研究

根据GenBank发表的绵羊布鲁氏菌标准菌株(63/290)的omp25基因序列设计引物,以新疆地区绵羊布鲁氏菌(80/019)基因组DNA为模板,探索PCR反应的各种条件以确定最适PCR反应条件。结果扩增出清晰的omp25目的基因片段,为今后进行omp25的分子生物学特性的研究奠定基础。

羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。

pEGFP-N1-omp25荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25基因并构建荧光真核表达载体p EGFP-N1-omp25,检测其在大鼠脑内的表达。方法根据Genebank中omp25基因的核苷酸序列,设计并合成1对引物,以布鲁氏杆菌总基因组DNA为模板,进行PCR扩增得到omp25基因片段,并将omp25基因片段及质粒p EGFP-N1分别进行进行酶切、体外连接,使其定向重组,构建其重组质粒。将制备的重组质粒经侧脑室注射至大鼠,检测p EGFP-N1-omp25在大鼠脑内的表达。结果 PCR扩增出642bp大小的片段,挑取的LB固体培养基上的单菌落经菌液PCR、酶切、测序表明成功构建了p EGFP-N1-omp25荧光真核表达载体。质粒经大鼠侧脑室注射后,脑组织冰冻切片可见荧光表达。结论采用体外重组技术,成功构建了布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25基因的真核表达载体,且重组质粒在大鼠脑组织内成功表达。

羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。

omp25c基因对马耳他布鲁菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响

目的:初步评价马耳他布鲁菌M5疫苗株omp25c基因对其毒力及免疫保护性的影响。方法:利用同源重组的方法,用卡那霉素抗性基因替换M5的omp25c(BMEI1829)基因,得到缺失突变株M5Δomp25c;分别用M5Δomp25c和M5免疫小鼠,在免疫后不同时间点处死小鼠,通过脾脏细菌计数分析缺失突变株在小鼠体内的毒力,通过检测IgG和IFN-γ的水平分析缺失突变株在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答能力,通过攻毒实验评价突变株的免疫保护效果。结果:与M5株相比,M5Δomp25c在小鼠脾脏内的存活时间较短,在第4周时未能检出;M5Δomp25c免疫小鼠诱导产生的IgG水平在第4周达到最高,第6周开始下降;M5Δomp25c免疫小鼠诱导分泌的IFN-γ水平在第4周达到最高为790pg/mL,第6周时浓度降至530pg/mL,整体趋势显著低于阳性对照组;接种了M5Δomp25c的小鼠用布鲁菌强毒株16M攻毒后,免疫保护效果也下降。结论:缺失omp25c的突变株毒力减弱,诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果下降,说明omp25c基因是马耳他布鲁菌M5疫苗株的毒力相关基因,对疫苗株M5的免疫应答和免疫保护效果有一定的影响。

牛布鲁氏菌OMP25的原核表达及表达产物的免疫学特性

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP25的克隆、测序和表达,并对其进行免疫特性检测。方法采用PCR技术对牛布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因进行了扩增和克隆测序,并成功构建了原核表达质粒pGEX-OMP25。将其转入E.coliBL21,经IPTG诱导表达,用电洗脱纯化后获得了高纯度的目的蛋白。纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清。结论通过ELISA、Western-blotting分析及特异性检测试验,证明目的蛋白不仅具有抗原性且有良好的免疫反性。

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。

布鲁菌外膜蛋白OMP25的原核表达

为了克隆布鲁菌外膜蛋白OMP25基因并构建基因的原核表达系统,试验采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到布鲁菌基因组OMP25基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pET-32a,经双酶切和DNA测序,再将构建的重组质粒转化到E.coilDH5α、Rosetta,经IPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白pET32a-OMP25的表达情况。结果表明:经DNA测序显示OMP25基因序列和插入位点正确,成功构建了重组质粒pET32a-OMP25,经IPTG诱导表达出以包涵体形式存在的长为43 ku的OMP25融合蛋白;经Western-blot检测,OMP25融合蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。

布鲁氏菌omp25基因真核表达载体的构建与分析

构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。

家畜布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因的原核表达及其应用

为了获得活性良好的布鲁氏菌基因工程抗原,对Brucella OMP25蛋白进行原核表达及初步应用,试验采用PCR方法从布鲁氏菌病S2疫苗株中扩增获得OMP25基因,构建了原核表达质粒p GEX-6P-1-OMP25,转化入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导表达,应用Western-blot方法鉴定表达产物,并以纯化的OMP25重组蛋白为诊断用抗原,通过反应条件优化,初步建立Brucella抗体ELISA检测方法。又以羊布鲁氏菌普查检测血清120份为样本,采用试管凝集试验进行了比较分析。结果表明:成功构建了pGEX-6P-1-OMP25原核表达载体,并在BL21中得以诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot分析,重组蛋白分子质量约为49 ku,优化试验确定抗原的最佳包被浓度为3.5μg/m L,血清最佳稀释度为1∶20。试管凝集试验血清样本的阳性率为83%,采用OMP25作为包被抗原的阳性检出率为68%,二者的符合率为85%。说明OMP25作为间接ELISA包被抗原用于羊布鲁氏菌血清学检测具有良好的反应性和特异性。

布鲁氏菌Omp25蛋白抗原表位的生物信息学分析

目的利用生物信息学方法对羊布鲁氏菌Omp25蛋白进行分析,预测其T细胞以及B细胞的优势抗原表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的Omp25蛋白的氨基酸序列。应用ProtParam在线软件分析Omp25蛋白的理化性质,应用SOMPA在线软件分析Omp25蛋白二级结构,应用Phyre2及SWISS-MODEL在线软件构建并分析Omp25蛋白三级结构,应用ABCpred和BepiPred等在线软件预测Omp25蛋白的B细胞抗原表位,应用SYFPEITHI和IEDB在线软件预测Omp25蛋白的T细胞抗原表位。结果Omp25蛋白含有23个强碱性氨基酸,含有21个强酸性氨基酸,归类为亲水性稳定蛋白,Omp25蛋白的二级结构中α-螺旋占24.88%,β-折叠占25.35%,β-转角占2.82%,无规则卷曲占46.95%。联合不同软件的预测结果分析后,最终获得1段CD4^+T细胞优势抗原表位、3段CD8^+T细胞优势抗原表位以及3段B细胞优势抗原表位。结论通过生物学信息的方法较为全面地预测了羊布鲁氏菌Omp25蛋白的优势T细胞以及B细胞抗原表位,为进一步研制羊布鲁氏菌表位疫苗构建提供了理论基础。

羊种布鲁菌omp25的原核表达与免疫原性检测

目的在大肠杆菌中表达羊种布鲁菌omp25基因并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法从羊种布鲁菌中用聚合酶链反应技术(PCR)扩增得到布鲁菌omp25基因片段,并将目的基因插入原核表达载体PET-32a中,构建重组质粒PET-32a/omp25转入大肠杆菌E.coli Rosetta中并进行诱导表达,用SDS-PAGE和western-blot检测表达蛋白。结果成功构建了重组质粒PET-32a/omp25,并在大肠杆菌Rosetta中获得了重组蛋白,重组蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应。结论重组质粒PET-32a/omp25可以在大肠杆菌Rosetta中成功表达,并且重组蛋白可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明该重组蛋白有良好的免疫原性,该研究为疫苗的研制及布鲁菌病的检测打下良好的基础。

马耳他布鲁菌omp25的原核表达与免疫原性检测

为在大肠杆菌中表达马耳他布鲁菌omp25基因并鉴定重组蛋白的抗原性,从马耳他布鲁菌中用聚合酶链反应技术(PCR)扩增得到布鲁菌omp25基因片段,并将目的基因插入原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-omp25转入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western-blot检测表达蛋白。结果显示成功构建了重组质粒pET-32a-omp25,并在大肠杆菌Rosetta中获得了重组蛋白,重组蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应。表明重组质粒pET-32a-omp25可以在大肠杆菌Rosetta中成功表达,并且重组蛋白可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明该重组蛋白有良好的免疫原性,该研究为以后疫苗的研制及布鲁菌病的检测打下良好的基础。