脐血干细胞表达转基因TNF-α联合溶瘤病毒对小鼠胃癌移植瘤抑制和杀伤作用

目的探讨脐血间质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)表达转基因肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)联合溶瘤病毒-新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)抑制和杀伤胃癌的作用。方法构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,感染人脐血间质干细胞,获得重组慢病毒感染的脐血间质干细胞(MSC-TNF-α)。人胃癌细胞SGC-7901注射到裸鼠腹股沟皮下建立胃癌移植瘤裸鼠模型,荷瘤裸鼠分为MSC-TNF-α组、MSC-TNF-α联合溶瘤病毒组和生理盐水(NaCl)对照组,每组5只;对3组裸鼠瘤周分别注射MSC-TNF-α、MSC-TNF-α+溶瘤病毒和NaCl,隔日1次,共3次;第4周取材,观察注射前后瘤体生长情况。反转录PCR法测定3组胃癌组织中TNF-αmRNA表达;病理切片观察瘤体坏死面积及肿瘤细胞凋亡情况。结果 MSC-TNF-α组裸鼠肿瘤体积为(1.40±0.23)cm3,MSC-TNF-α+溶瘤病毒组为(0.94±0.28)cm3,NaCl组为(2.88±0.28)cm3,MSC-TNF-α+溶瘤病毒组与MSC-TNF-α组比较,差异有统计学意义,t=2.39,P=0.044;MSC-TNF-α组与NaCl组比较,差异有统计学意义,t=7.72,P<0.001。MSC-TNF-α组TNF-αmRNA相对表达量为5.96±0.87,NaCl组为1.71±0.75,两组比较差异有统计学意义,t=6.652,P<0.001;MSC-TNF-α+溶瘤病毒组为5.81±1.11,与NaCl组比较,差异有统计学意义,t=6.423,P<0.001;MSC-TNF-α组与MSC-TNF-α+溶瘤病毒组比较,差异无统计学意义,t=0.229,P=0.825。病理切片显示,MSC-TNF-α+溶瘤病毒组坏死面积最大。Hoechst凋亡检测示,MSC-TNF-α+溶瘤病毒组细胞凋亡率最高,两治疗组肝脏和肾脏功能检测均正常。结论转基因脐血间质干细胞旁分泌TNF-α联合溶瘤病毒对胃癌细胞具有明显的抑制杀伤作用。

携带人肝细胞生长因子第一结构域基因溶瘤腺病毒的构建及其对胃癌细胞的杀伤作用

目的构建携带具有抗肿瘤细胞和抗血管生成作用的人肝细胞生长因子第一结构域（HGFK1）基因的肿瘤特异性启动子调控的溶瘤腺病毒，研究其对胃癌细胞选择性杀伤作用。方法以人端粒酶反转录酶启动子（hTERT）和缺氧调控元件序列（HRE）分别调控溶瘤腺病毒复制必要的E1a和E1b基因，基因组插入HGFK1基因，构建HGFK1溶瘤腺病毒（TH—Ad—HGFK1-EGFP）和无HGFK1溶瘤腺病毒（TH—Ad—EGFP），空斑计数法滴定病毒浓度；病毒分为3组：实验A组（TH-Ad—HGFK1-EGFP）、实验B组（TH-Ad—EGFP）和对照C组（Ad-EGFP），分别感染胃癌细胞SGC7901和正常人成纤维细胞（HF）；半数细胞培养物感染量法（TCID50）检测病毒扩增倍数；噻唑蓝（MTT）法检测病毒杀伤抑制作用；双重荧光染色检测病毒促凋亡作用。结果溶瘤腺病毒TH—Ad—HGFK1-EGFP、TH-Ad—EGFP经测序及聚合酶链反应（PCR）鉴定确认构建成功，滴度都为2×10^10pfu／ml；病毒扩增结果显示：A、B组病毒在SGC7901细胞中的扩增倍数分别为1．47×10^4、1．60×10^4倍，远大于对照C组病毒，在HF细胞中为110倍和124倍，远小于对照C组病毒；MTF结果显示：当感染复数（MOI）=100时，A组病毒对SGC7901细胞72、96h后的抑制率为（71．34±8．27）％、（74．56±1．78）％，B组为（30．58±3．83）％、（31．84±6．62）％，C组为（23．40±2．29）％、（21．18-4-2．32）％。A组与B组两时间点分别比较差异有统计学意义（P=0．002、P=0．003），A组与C组分别比较差异有统计学意义（P=0．003、P=0．000）。A、B组病毒对HF细胞在96h后的抑制率为（18．94±0．88）％、（22．84±3．34）％，C组为（53．25±3．50）％，A、B两组与C组分别比较差异有统计学意义（P=0．003、P=0．001）；凋亡结果显示：A组SGC7901细胞的凋亡率为（18．66±4．04）％，远高于其余各组。结论溶瘤腺病毒TH—Ad—HGFK1-EGFP能在胃癌细胞SGC7901中复制增殖并对其有杀伤抑制、促凋亡作用。