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鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 陈立功 穆英丽 +5 位作者 张诚 潘保革 范乐乐 魏忠华 王学静 刘聚祥 《中国家禽》 北大核心 2025年第2期53-59,共7页
为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础... 为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础上,分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线,进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性,建立的方法用于临床样品的检测,并与文献报道的常规RT-PCR方法进行比较。结果显示:优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40(或0.50)μmol/L,探针浓度均为0.50μmol/L,扩增线性范围分别为3.26×10^(3)~3.26×10^(8)拷贝/μL和7.09×10^(3)~7.09×10^(8)拷贝/μL,相关系数均为0.998;该方法可特异性检出两种GAstV,但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号;其检测限分别为3.26×10^(2)拷贝/μL和7.09×10^(1)拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测结果显示,GAstV阳性率为90.57%(96/106);而文献报道的常规RT-PCR方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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牛阿卡斑病RT-PCR检测方法的建立
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作者 尚佳富 李明科 +6 位作者 徐婷婷 杨晓伟 刘霞 张立武 曹礼静 倪兴维 赵光伟 《贵州农业科学》 2025年第1期55-61,共7页
【目的】建立牛阿卡斑病(Akabane disease,AKAD)RT-PCR实验室快速检测方法,为该病的临床防控提供技术支撑。【方法】参考前期获得的阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)S基因序列(OR791104.1),针对其保守区域设计特异性扩增引物,以构建的pMD... 【目的】建立牛阿卡斑病(Akabane disease,AKAD)RT-PCR实验室快速检测方法,为该病的临床防控提供技术支撑。【方法】参考前期获得的阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)S基因序列(OR791104.1),针对其保守区域设计特异性扩增引物,以构建的pMD-AKAV重组质粒为模板,建立RT-PCR检测方法,并对其扩增条件进行优化,进而对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,最后将所建方法对实验室保存的19份阳性和279份阴性牛血清临床样本进行符合性检测,验证该方法的准确性。【结果】所建方法的最佳反应条件为95℃预变性3 min;95℃变性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸15 s,共37个循环;72℃延伸5 min。对牛蓝舌病病毒、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛支原体等病原均为阴性,特异性良好;对阳性质粒检测最低限为2.5×10^(3) copies/μL,灵敏性高;重复性试验显示不同批次样本检测结果均一致,可重复性强;对实验室保存的298份(19份阳性、279份阴性)临床样本进行检测,其结果均与预期一致,符合率100%。【结论】建立的牛阿卡斑病RT-PCR检测方法特异性良好、灵敏性高、可重复性强。 展开更多
关键词 赤羽病 阿卡斑病毒 rt-pcr 检测 防控
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Key Steps and Catalyst Performance for Conversion of Cellulose to Isosorbide: AReview
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作者 Dan Wang Jihuan Song +2 位作者 Qiyuan Wang Chenmeng Cui Ying Yang 《Journal of Renewable Materials》 2025年第1期49-78,共30页
Upgrading of abundant cellulosic biomass to isosorbide can reduce the dependence on limited fossil resources and provide a sustainable way to produce isosorbide,utilized for polymers,medicine and health care product s... Upgrading of abundant cellulosic biomass to isosorbide can reduce the dependence on limited fossil resources and provide a sustainable way to produce isosorbide,utilized for polymers,medicine and health care product synth-esis.This review comprehensively examines the key steps and catalytic systems involved in the conversion of cel-lulose to isosorbide.Initially,the reaction pathway from cellulose to isosorbide is elucidated,emphasizing three critical steps:cellulose hydrolysis,glucose hydrogenation,and the two-step dehydration of sorbitol to produce isosorbide.Additionally,the activation energy and acidic sites during cellulose hydrolysis,the impact of metal particle size and catalyst support on hydrogenation,and the effects of catalyst acidity,pore structure,and reaction conditions on sorbitol dehydration have been thoroughly examined.Finally,the progress made in cellulose con-version to isosorbide is summarized,current challenges are highlighted,and future development trends are pro-jected in this review. 展开更多
关键词 CELLULOSE ISOSORBIDE reaction pathway key steps catalytic systems
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蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立
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作者 马晓菁 谷文喜 +5 位作者 叶锋 刘帅 刘丽娅 谢彩云 钟旗 易新萍 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期253-259,共7页
【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blas... 【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。 展开更多
关键词 蓝舌病 VP7蛋白 rt-pcr
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猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用
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作者 龚婷 马辉 +1 位作者 郭宏伟 郑鸣 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期18-22,29,共6页
为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-... 为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 变异毒株 一步法rt-pcr鉴别检测方法 临床应用 流行规律
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河南郑州桃园桃病毒T的RT-PCR检测
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作者 王新卫 刘立立 +6 位作者 方伟超 陈昌文 朱更瑞 曹珂 李勇 吴金龙 王力荣 《中国果树》 2024年第9期86-89,共4页
通过选取河南省郑州市周边桃园生长不正常的树体叶片,进行RT-PCR检测桃病毒T的感染。结果表明,18份样品中检测到了6份样品存在病毒感染,检出率为33.3%。检出病毒的桃树样品分布在新郑市多个乡镇的果园,共有5个品种检出病毒;来自巩义市... 通过选取河南省郑州市周边桃园生长不正常的树体叶片,进行RT-PCR检测桃病毒T的感染。结果表明,18份样品中检测到了6份样品存在病毒感染,检出率为33.3%。检出病毒的桃树样品分布在新郑市多个乡镇的果园,共有5个品种检出病毒;来自巩义市的样品未检测出桃病毒T。检出病毒的桃品种既有生产上的老品种,又有近几年栽植的新品种。结合多个桃园的病毒检出,说明病毒T已在生产中存在较长时间,并在局部区域呈扩散趋势。 展开更多
关键词 桃园 病毒病防控 rt-pcr 桃病毒T(PVT) 感染
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帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:1
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作者 杨恒 李占鸿 +5 位作者 宋子昂 高林 李卓然 廖德芳 肖雷 李华春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期395-400,共6页
本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,... 本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。 展开更多
关键词 帕利亚姆病毒 血清型鉴定 实时荧光定量rt-pcr 检测方法
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A Rapid and Sensitive One Step-SYBR Green Based Semi Quantitative Real Time RT-PCR for the Detection of peste des petits ruminants Virus in the Clinical Samples 被引量:10
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作者 Vinayagamurthy Balamurugan Arnab Sen +4 位作者 Gnanavel Venkatesan Vinita Yadav Vandna Bhanot Veerakyathappa Bhanuprakash Raj Kumar Singh 《Virologica Sinica》 CAS CSCD 2012年第1期1-9,共9页
A sensitive and rapid single step real time (rt) RT-PCR was standardized using one-step Brilliant SYBR Green kit for detection and semi-quantitation ofpeste des petitis ruminants virus (PPRV) using the virus RNA a... A sensitive and rapid single step real time (rt) RT-PCR was standardized using one-step Brilliant SYBR Green kit for detection and semi-quantitation ofpeste des petitis ruminants virus (PPRV) using the virus RNA and matrix (M) protein gene-specific primers and compared with established conventional RT-PCR and TaqMan RT-PCR. The assay amplifies a 124 bp fragment of the PPRV M gene with Tm of 78.28 to 78.50. The assay was linear within a range of 50 ng to 0.5 fg total virus RNA with a detection limit (sensitivity) of 0.5 fg. Based on the serial dilution of the live-attenuated PPR vaccine virus, the detection limit was -0.0001 cell culture infectious dose 50% units (TCID50). Additionally, swab materials spiked with known titre of vaccine virus were equally well detected in the assay. The standardized rt RT-PCR was easily employed for the detection of PPRV nucleic acid directly in the field and experimental clinical samples. The assay detected the PPRV nucleic acid as early as 3 day post infection (dpi) and up to 20 dpi in swab materials from the experimental samples. The assay was rapid and more sensitive than TaqMan and conventional RT-PCR in the detection of PPRV nucleic acid from the PPR suspected clinical samples of sheep and goats. Therefore, the established, simplified SYBR green rt RT-PCR is an alternative test to the already existing various diagnostic assays and could be useful for rapid clinical diagnosis with advantage in reducing risk of contamination. 展开更多
关键词 PPR M gene SYBR green rt-pcr Early diagnosis Clinical samples
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Rapid Detection Co-infections of Classical Swine Fever Virus and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus by One-step Multiplex RT-PCR 被引量:1
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作者 TIAN Hong WU Jinyan YAN Chen SHANG Youjun YIN Shuanghui LIU Xiangtao 《Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)》 CAS 2011年第4期50-54,共5页
Classical swine fever virus (CSFV) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) have caused immense economic loss in the pig industry and are considered to be the two most important infectious d... Classical swine fever virus (CSFV) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) have caused immense economic loss in the pig industry and are considered to be the two most important infectious diseases of pigs in the world A multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (multiplex RT-PCR) was developed for CSFV and PRRSV co-infections or infections, respectively. A set of two pairs of primer was designed based on the sequence of nonstructural protein NS54B of CSFV and ORF7 gene of PRRSV. The diagnostic accuracy of multiplex RT-PCR assay was evaluated by using 56 field clinical samples by multiplex RT-PCR, single RT-PCR and sequence analysis; and the specificity of multiplex PCR was verified by using constructed plasmids containing the specific viral target fragments of PRRSV and CSFV, respectively. The results indicated that this assay could reliably differentiate PRRSV and CSFV in co-infection samples. The multiplex RT-PCR developed in this study might provide a new avenue to the rapid the detection of CSFV and PRRSV in one reaction. 展开更多
关键词 CSFV PRRSV multiplex rt-pcr CO-INFECTION
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Discrepancy of Classical Swine Fever Virus in Different Tissues by One-Step RT-PCR and Nested RT-PCR 被引量:3
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作者 YIN Shuang-hui TIAN Hong +3 位作者 SHANG You-jun YANG Shun-li WU Jin-yan LIU Xiang-tao 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2010年第3期18-20,共3页
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used for the detection of classical swine fever virus (CSFV) in blood and tissue samples of field cases and experimentally inoculated pigs. The distribution... Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used for the detection of classical swine fever virus (CSFV) in blood and tissue samples of field cases and experimentally inoculated pigs. The distribution of CSFV in different organ samples showed some discrepancies in infected pigs. Four weaner pigs were inoculated with C-strain vaccine virus, then samples of spleen, tonsil, lung, mesenteric lymph node, kidney and brain were collected after slaughter and tested for E2 and NS5B genes using one-step RT-PCR and nested RT-PCR. Using the same method, 12 field cases were simultaneously studied. A discrepancy of CSFV in different samples was found upon detecting the target gene. The most reliable diagnostic organs were spleen and tonsil, and the nested RT-PCR assay provided a highly sensitive and specific method with comparable performance to the one-step RT-PCR assay. 展开更多
关键词 Classical swine fever virus E2 gene NS5B gene TISSUES rt-pcr
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猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立
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作者 于浩洋 王彩霞 +5 位作者 仇松寅 刘晓飞 景宏丽 吴绍强 冯春燕 林祥梅 《中国动物检疫》 CAS 2024年第1期95-101,共7页
猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方... 猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。 展开更多
关键词 猪Linda病毒 巢式rt-pcr 检测方法 非典型瘟病毒
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基于RT-PCR方法对河北省桃病毒和类病毒种类的调查鉴定
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作者 荣春蕊 李晓颍 +7 位作者 苏凯 张晨光 肖坤 李刚 武军凯 肖啸 张立彬 刘春生 《中国果树》 2024年第8期94-97,103,共5页
病毒是造成桃果实产量和品质下降的原因之一,RT-PCR是检测病毒的常用分子生物学方法。利用RT-PCR方法对河北省113份桃样品进行了13种病毒的检测,结果表明,检测到的10种病毒包括ACLSV、PBNSPaV、HSVd、NSPaV、PNRSV、PaLV、PLMVD、APCLSV... 病毒是造成桃果实产量和品质下降的原因之一,RT-PCR是检测病毒的常用分子生物学方法。利用RT-PCR方法对河北省113份桃样品进行了13种病毒的检测,结果表明,检测到的10种病毒包括ACLSV、PBNSPaV、HSVd、NSPaV、PNRSV、PaLV、PLMVD、APCLSV、PeVD和PPV,其中ACLSV检测率最高,其次是PBNSPaV和HSVd 2种病毒。病毒具有复合侵染的现象,三重侵染和四重侵染的检测率最高,没有检测到不被病毒侵染和单一侵染的样品。研究结果为河北省桃病毒脱除、无病毒苗木繁育奠定了理论基础。 展开更多
关键词 河北省 病毒 rt-pcr
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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张靖鹏 陈翠腾 +5 位作者 林琳 付环茹 李兆龙 江斌 黄瑜 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期860-866,共7页
旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。 展开更多
关键词 信鸽 鸽微RNA病毒 3 C基因 序列分析 实时荧光定量rt-pcr方法
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非洲马瘟病毒和西尼罗病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 钱佳豪 刘丹 +8 位作者 周师众 张博源 高建帅 蒋卉 范学政 张广智 丁家波 王春凤 沈青春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5873-5879,共7页
本研究旨在建立一种可同时检测非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法。根据AHSV VP 7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,... 本研究旨在建立一种可同时检测非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法。根据AHSV VP 7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,优化反应条件及体系,绘制标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行测定,并采用该方法对临床样品进行检测验证。结果显示:该方法能够同时检测AHSV和WNV,且特异性良好,与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马传染性贫血病毒、马腺疫链球菌、马流感病毒等马病核酸均无交叉反应;敏感性高,AHSV和WNV最低检测限均为10 copies·μL^(-1);组内变异系数为0.04%~0.93%,组间变异系数为0.17%~4.83%,重复性良好;使用该方法对30份马全血样品进行检测,结果均为阴性。本试验建立的检测方法对马属动物检疫、非洲马瘟和西尼罗热的监测与防控具有重要意义。 展开更多
关键词 双重荧光定量rt-pcr 非洲马瘟病毒 西尼罗病毒
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赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 李超 王素春 +5 位作者 隋金钰 潘俊慧 魏世萌 祁倩 周凯钰太 王楷宬 《中国动物检疫》 CAS 2024年第9期111-117,共7页
为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并... 为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 实时荧光定量rt-pcr 方法建立 初步应用
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3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立
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作者 李紫腾 潘媛 +4 位作者 马子文 胡同乐 王树桐 曹克强 王亚南 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期84-92,共9页
苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病... 苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 苹果茎沟病毒 苹果茎痘病毒 苹果坏死花叶病毒 荧光定量rt-pcr检测体系
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柑橘3种病毒类病原多重RT-PCR检测技术的建立及应用
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作者 袁琳凯 马崇欢 +5 位作者 李丁山 陈志炜 江宵烽 丁新伦 张洁 吴祖建 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期339-344,共6页
【目的】建立柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和啤酒花矮化类病毒(hop stunt viroid,HSVd)的多重RT-PCR检测体系。【方法】设计多重RT-PCR引物,分析其特异性,确... 【目的】建立柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和啤酒花矮化类病毒(hop stunt viroid,HSVd)的多重RT-PCR检测体系。【方法】设计多重RT-PCR引物,分析其特异性,确定其最佳浓度比、最适退火温度及灵敏度,在此基础上对福建地区的柑橘样品进行检测。【结果】确定了CYVCV-F/R、CTV-F/R和HSVd-F/R等3对引物的最佳浓度比例为1∶1∶2,最适退火温度为52.9℃,灵敏度结果显示该体系可检测模板稀释到10^(-2)的阳性样品。应用该体系对采自福建部分地区的157份柑橘样品进行检测,结果发现,CYVCV、CTV和HSVd的检出率分别为47.1%、56.7%和22.9%。【结论】成功建立了柑橘CYVCV、CTV和HSVd病原的多重RT-PCR检测方法,为该类病害的检测提供准确、快速的检测方法。 展开更多
关键词 柑橘黄化脉明病毒 柑橘衰退病毒 啤酒花矮化类病毒 多重rt-pcr
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 李鹏飞 高桂琴 +6 位作者 周广青 吴锦艳 颜新敏 曹小安 何继军 袁莉刚 尚佑军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2259-2266,共8页
山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在... 山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 羊内源性逆转录病毒 TAQMAN 荧光定量rt-pcr
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韦塞尔斯布朗病病毒RT-PCR快速检测方法的建立及应用
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作者 王奕婷 张风荣 +5 位作者 冯之航 郁蕾 薛俊欣 陈翔 王艳 赵光伟 《中国动物检疫》 CAS 2024年第10期96-101,共6页
为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的... 为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的两种方法的核酸检测下限分别为10、100 copies/μL,对日本脑炎病毒、西尼罗病毒和坦布苏病毒核酸均无交叉反应;分别利用建立的两种检测方法对100份入境马匹样品进行检测,未检出WSLV阳性,与南非参考实验室提供的双重荧光RT-PCR检测方法结果一致。结果说明,所建的两种方法敏感性高、特异性强,可用于临床样本检测,为韦塞尔斯布朗病的出入境检验检疫、流行病学调查及防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 韦塞尔斯布朗病病毒 荧光定量rt-pcr rt-pcr 快速检测
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番茄环斑病毒半巢式荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 孟祥谦 邹宗峰 +3 位作者 于凯 王雪 李金庆 缪玉刚 《植物检疫》 2024年第4期34-38,共5页
为准确高效地检测出植物样品中的番茄环斑病毒,提高检疫效率,本研究结合了巢式PCR技术和实时荧光定量PCR技术,根据番茄环斑病毒外壳蛋白基因保守区序列设计了3条特异性引物和一条TaqMan探针,成功建立了半巢式荧光定量RT-PCR检测番茄环... 为准确高效地检测出植物样品中的番茄环斑病毒,提高检疫效率,本研究结合了巢式PCR技术和实时荧光定量PCR技术,根据番茄环斑病毒外壳蛋白基因保守区序列设计了3条特异性引物和一条TaqMan探针,成功建立了半巢式荧光定量RT-PCR检测番茄环斑病毒的方法。该方法通过两轮实时荧光PCR扩增发现只有在番茄环斑病毒侵染的植物样品中出现荧光扩增曲线,而感染TRSV、SBMV、TSWV、PDV、BPMV的植物样品和健康叶片的c DNA及对照ddH2O未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性。根据梯度稀释法测得荧光扩增信号的最低浓度为498 ag/μL植物总RNA,说明该方法灵敏度较高,且重复性良好。两套引物探针的扩增效率对比试验结果表明第一套引物探针扩增效率小于第二套引物探针扩增效率。本研究建立的半巢式荧光定量RT-PCR检测番茄环斑病毒的方法具有特异性强、灵敏度高等特点,通过两轮实时荧光PCR检测相互验证,大大降低了假阳性结果的出现,是一种准确高效的检测方法。 展开更多
关键词 番茄环斑病毒 半巢式荧光定量rt-pcr 特异性 灵敏度
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