转OsMAPK4基因烟草的抗旱性研究与遗传分析

以低温处理的水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出OsMAPK4基因,构建了由E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12。通过农杆菌介导法将OsMAPK4基因导入烟草,筛选获得25株转基因植株。抗旱性研究结果表明,OsMAPK4基因的超量表达提高了T1代转基因植株的抗旱性。卡那霉素抗性在T1代转基因植株中的分离情况表明,大多数转基因株系符合单基因遗传规律。

转OsMAPK4基因水稻耐盐性分析

构建了由组成型启动子E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pCME12,利用农杆菌介导法转化黑龙江省主栽品种五优稻1号水稻愈伤组织,Southern杂交检测表明,OsMAPK4基因整合到水稻基因组上,获得了转基因水稻植株。对转基因水稻在种子发芽期和苗期进行了耐盐性分析,结果表明,转基因水稻种子在含0.2mol·L-1NaCl的培养基上能正常萌发;转基因水稻幼苗在0.4mol·L-1NaCl处理时茎部仍然为绿色,种子萌发与幼苗生长情况略优于非转基因植株栽至无盐土壤中,植株能萌发出新叶片。

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。

转耐盐基因OsCDPK7、OsMAPK4水稻农艺性状调查与分析

在前期已获得耐盐转OsCDPK7、OsMAPK4基因水稻的基础上,对转基因株系的产量性状、生物学性状、品质性状和生育期等农艺性状进行调查与分析。结果表明,在田间栽培条件下,转基因水稻植株个体生长发育正常,转OsCDPK7基因水稻株系主要农艺性状与对照无差异;而转OsMAPK4基因水稻株系与其受体之间单位面积产量、株高、有效穗数和粗蛋白含量等均存在显著差异。这种差异与OsMAPK4基因功能存在必然关系。