基于CRISPR/Cas9系统的OsbHLH116基因编辑及其脱靶效应分析

以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相结合的方法对OsbHLH116突变体进行了筛选鉴定和脱靶效应分析。结果表明,所构建的pBUN411-gRNA载体成功实现了对基因OsbHLH116的定向编辑。酶切分析表明在选取的10株T0代转基因苗中得到了6个OsbHLH116突变单株。对6个突变单株进行了TA克隆测序分析,发现了纯合突变、双等位突变和杂合突变3种类型。酶切分析表明2个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。

水稻OsbHLH116基因简易RNAi载体构建与功能初步分析

水稻OsbHLH116基因属于bHLH家族转录因子。本研究依据简易RNAi技术原理,在OsbHLH116基因编码区选取一段60 bp序列作为干扰目的片段,根据目的片段序列化学合成2条长寡核苷酸链,使其3'端9个碱基互补配对,经退火延伸得到具有反向重复序列的小干扰片段。小干扰片段和载体pTCK303经一次酶切和连接即可得到OsbHLH116-RNAi表达载体。经菌落PCR验证后利用农杆菌介导法转化水稻品种新丰2号,利用GUS染色筛选获得转基因阳性植株。通过qRT-PCR对选取的三组转基因株系中OsbHLH116基因表达量验证,结果显示OsbHLH116基因表达极显著降低,表明OsbHLH116基因简易RNAi载体构建成功并发挥干扰作用。对OsbHLH116基因功能进行初步分析发现,与野生型新丰2号相比,OsbHLH116-RNAi株系种子萌发率显著降低。