清络通痹颗粒通过MAPKs信号通路干预共培养诱生的破骨样细胞的分化

目的:研究MAPKs通路对共培养诱生的破骨样细胞分化和活性的调控及清络通痹颗粒对MAPKs通路的影响。方法:分离佐剂性关节炎大鼠外周血单核细胞和滑膜成纤维细胞,共培养诱生破骨样细胞;共培养体系加入MAPK抑制剂观察破骨细胞的增殖、TRAP活性和骨吸收功能的变化;加入清络通痹颗粒含药血清,实时定量PCR观察其对破骨样细胞ERK、JNK和p38表达的影响,Western blot法观察其对破骨样细胞磷酸化ERK、JNK和p38表达的影响。结果:加入MAPK抑制剂U0126、SP600125、SB203580后,共培养诱生的破骨样细胞增殖能力、TRAP活性和骨吸收面积均受到明显抑制;清络通痹颗粒3.6、7.2、14.4 g/kg给药的大鼠含药血清可不同程度抑制破骨样细胞ERK、JNK和p38的表达,可明显抑制破骨样细胞磷酸化ERK、JNK和p38的表达。结论:MAPKs通路在破骨细胞分化过程中起着重要的作用,清络通痹颗粒可抑制MAPKs通路的活化而进一步抑制破骨细胞的分化、增殖和活性。

破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路

破骨细胞从起源发育至成熟,再经活化发挥吸收作用是一个复杂的多级调控过程,始终都受到一系列细胞因子的影响。有些细胞因子对破骨细胞的成熟分化起促进作用,如:RANKL、TNF-α、IL-1、IL-6、1,25-(OH)2D3、PTH、M-CSF等,其中RANKL和M-CSF是破骨细胞形成和分化过程中的两个必需的因子;有些因子起抑制作用,如:OPG、IL-4、IL-10、雌激素、降钙素、TGF-β等。OPG/RANK/RANKL系统在破骨细胞分化成熟过程中起着枢纽作用,大部分细胞因子都直接或间接地通过OPG/RANK/RANKL系统来发挥作用,其中还涉及到成骨细胞、破骨细胞、基质细胞等复杂的相互作用。介导破骨细胞分化成熟的各种细胞因子反应的信号传导路径主要包括MAPK、NF-kappaB、CN/NFAT等通路,全面地了解破骨细胞因子及其信号传导通路,将有助于临床更好地分析各种骨代谢性疾病的病因及发病机制,进而为治疗提供理论依据。

骨形成因子及其信号传导通路述评

骨生成和骨重建是成骨细胞和破骨细胞共同作用的结果。一方面,成骨细胞在骨形成中受多因素影响,特别是骨形态发生蛋白(BMP),它能诱导间充质细胞向软骨转化,并能在细胞和细胞间质之间进行信号传导,包括Smads路径、MAPKs路径。另一方面,破骨细胞的骨吸收作用主要受OPG、RANKL、1,25-(OH)2D3等作用,其信号传导通路主要有p38MAPK、CN/NFAT、PI3K/Akt等。通过以上两方面综述,为骨生成和骨重建提供有效的理论基础,从而为骨质疏松或运动后骨创伤的治疗和预防提供参考。

RANKL诱导破骨细胞前体细胞分化成熟

目的用核因子-KB受体活化因子配体（RANKL）诱导破骨细胞前体细胞分化成熟，建立获取成熟破骨细胞的方法。方法用破骨细胞前体细胞RAW264．7细胞为模型，RANKL诱导培养4～9d，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察TRAP阳性多核细胞形成，罗丹明-鬼笔环肽荧光染色观察纤维性肌动蛋白（F-actin）环，DAPI染色观察细胞核，甲苯胺蓝染色观察牛骨片表面的吸收陷窝情况。结果RANKL可诱导RAW264．7细胞形成TRAP染色阳性的多核细胞，形成F-actin环，骨片吸收陷窝明显。结论RANKL可诱导RAW264．7细胞向成熟破骨细胞分化，该诱导模型可用于破骨细胞分化研究。

外周血单个核细胞诱导培养破骨细胞

目的:从人外周血单个核细胞诱导培养获得高产量高纯度破骨细胞,为破骨细胞的体外研究提供丰富的细胞来源。方法:从外周血分离单个核细胞贴壁培养,采用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA联合消化,纯化后以RANKL和M-CSF加以诱导(A组),并与未经消化之传统方法(B组)比较。结果:与B组相比,A组可获得(1426±204)个破骨细胞(P<0.05),0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA联合消化可使破骨细胞纯化率达90%。诱导生成的破骨细胞TRAP染色阳性,功能试验显示具有噬骨能力。结论:联合消化结合RANKL/M-CSF诱导培养法可产生大量的破骨样细胞,方法简便而且经济实用。

破骨细胞在大鼠正畸牙移动性根吸收修复早期中的改变

目的初步研究大鼠正畸牙移动性根吸收修复早期中破骨细胞和骨保护因子（osteoprotegerin，OPG）的变化和规律，探讨破骨细胞在正畸导致的炎性牙根吸收修复中的作用。方法建立大鼠正畸牙移动性根吸收修复早期模型，免疫组化检测OPG的表达，TRAP染色观察破骨细胞的变化。结果实验第1天，OPG表达量下降，第3天以后逐渐恢复至生理水平。实验第1天起，TRAP染色阳性细胞逐渐减少，实验第7、10、14天，TRAP染色阳性数量已逐渐恢复至生理水平。结论施力终止后，大鼠牙根即停止吸收，并于1—3d后开始牙根修复，OPG的量与此过程密切相关。

调节破骨细胞分化的RANK特异性cDNA片段的研究

【目的】在生理条件下寻找调节破骨细胞(OC)分化的核转录因子NF-κB受体激动剂(RANK)的特异性cDNA功能片段,为研究OC分化机制提供理论基础。【方法】先将RANK膜内部分的1.2kb大小的cDNA分成20个片段,用缺失突变的方法构建出20个由肿瘤坏死因子受体1和RANK跨膜和膜内部分组成的TNFR1/RANK嵌合体的突变体,每一个突变体在RANK膜内部分含60bp缺失。再将RANK-cDNA第1561～1680bp之间的120bp片段分为10个片段,构建10个新的TNFR1/RANK突变体,每一个突变体在其RANK膜内部分含12bp缺失。用包装细胞PlatE分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过感染分别将这些逆转录病毒转染到肿瘤坏死因子受体1和2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞(BMM)中。用TNFɑ刺激后、观察哪一个突变体不能诱导OC形成。【结果】首先发现表达TNFR1/RANK1561-1620或TNFR1/RANK1621-1680的逆转录病毒感染的BMM不能分化成OC,然后在RANK-cDNA第1561～1680bp这个大的片段中又发现表达TNFR1/RANK1597-1608、TNFR1/RANK1609-1620、TNFR1/RANK1621-1632或TNFR1/RANK1633-1644的逆转录病毒感染的BMM也不能分化成OC。【结论】RANK-cDNA第1597～1644bp之间的48bp片段(5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′)对OC形成起决定性作用。

Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良

目的:通过改良细胞培养方案建立体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系。方法:向Raw264.7细胞培养液α-MEM中添加50μg·L-1 M-CSF、100μg·L-1 RANKL和1×10-8 mol·L-1 1α,25-(OH)2D3,于5%CO2、37℃孵箱中培养12d,每3d换液1次,每次换液前对细胞进行短暂消化。倒置显微镜下观察细胞形态变化,并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、FITCphalloidin染色和免疫荧光染色鉴定OC是否成熟并具有吞噬功能。结果:通过改良培养方法,在诱导过程中培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色,诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%;FITC-phalloidin染色,伴随着OC成熟,伪足内出现的束状伪足小体逐渐变为环形,最终融合带状肌动蛋白环环绕在胞质周围;免疫荧光染色,诱导12d后OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加,TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。提示获得的OC成熟并具有吞噬功能。结论:本实验通过改良培养方法,联合应用细胞因子50μg·L-1 M-CSF、100μg·L-1 RANKL和1×10-8 mol·L-1 1α,25-(OH)2D3建立了体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。

淫羊藿对RANKL、M-CSF诱导的破骨样细胞形成及FN表达的影响

建立RANKL、M-CSF诱导的破骨样细胞体外培养体系,采用细胞染色分析研究淫羊藿对RANKL和M-CSF诱导全骨髓细胞分化形成破骨样细胞的作用,并探讨FN在破骨样细胞形成过程中的作用,结果显示,淫羊藿能够抑制RANKL、M-CSF诱导的破骨样细胞的形成,FN与破骨样细胞的融合有关.

英卡膦酸盐对佐剂关节炎模型大鼠骨与关节的影响

目的:研究英卡膦酸盐对佐剂关节炎大鼠的关节炎症、肿胀以及结构破坏的影响。方法:35只雌性Lewis大白鼠随机分为5组:正常对照组、模型组和英卡膦酸盐低、中、高剂量组,每组7只。除正常对照组外,其余4组接种佛氏完全佐剂诱发关节炎。英卡膦酸盐3个剂量组自接种之日起,连续42d皮下注射英卡膦酸盐0·01,0·1和1mg·kg-1·d-1,qd。记录关节炎分数,测定后足肿胀程度,并观察大鼠后肢放射学和踝关节组织病理学变化。结果:与模型组比较,英卡膦酸盐剂量依赖性地降低关节炎分数和后足肿胀程度;大鼠后肢放射学和踝关节组织病理学变化显示,英卡膦酸盐减轻踝与足部骨、关节的变形破坏,X线分数和TRAP阳性细胞计数剂量依赖性的降低。结论:英卡膦酸盐对大鼠佐剂关节炎的关节炎症、肿胀以及结构破坏具有抑制作用,提示英卡膦酸盐可作为类风湿性关节炎的辅助预防治疗药物。

缬沙坦、灯盏花素对1型糖尿病大鼠破骨细胞的影响

目的研究体外培养的1型糖尿病大鼠破骨细胞的特点及缬沙坦、灯盏花素对破骨细胞的影响,探讨1型糖尿病骨丢失的机制。方法以链脲佐菌素(STZ)制成1型糖尿病大鼠模型并用缬沙坦、灯盏花素进行干预,实验分为正常对照组、1型糖尿病组、缬沙坦组、灯盏花素组。于制成模型后4周进行破骨细胞体外培养。结果1型糖尿病组和缬沙坦组大鼠体外培养的破骨细胞数量多于正常对照组,1型糖尿病组和缬沙坦组之间无差异;灯盏花素组体外培养的破骨细胞数量与正常对照组比较差异无显著性,但少于同期1型糖尿病组与缬沙坦组。结论1型糖尿病时破骨细胞数量增加,导致骨吸收大于骨形成,可能是1型糖尿病骨丢失的发病机制。灯盏花素治疗能影响体外培养的破骨细胞数量。

破骨细胞分化因子及信号转导通路与中医药对其分化的干预抑制作用

破骨细胞(osteoclast,OC)源于造血干细胞的单核-巨噬细胞前体分支,是完成骨吸收的主要细胞。其分化成熟过程是一个复杂的多级调控过程。OPG/RANK/RANKL系统在破骨细胞分化成熟过程中起着枢纽作用,一些细胞因子通过调节RANKL和OPG表达影响OC分化增殖。几条关键信号转导通路参与这一过程。中医药在干预抑制破骨细胞活性及调控其分化成熟过程方面有一定的优势。祖国医学在此方面发挥了很大作用,中医药治疗有着重要研究价值。该文就影响破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路和中医药对其的干预抑制作用做一综述。

重组人生长激素对去势大鼠正畸牙牙周组织改建的影响

目的:探讨重组人生长激素(recombinanthumangrowthhormone,rh-GH)对去势(ovariectomy,OVX)大鼠正畸牙移动后牙周组织细胞变化的影响。方法:30只7周龄SPF级雌性Wistar大鼠随机分为3组:对照组、去势盐水组(OVX-NS组)和去势生长激素组(OVX-GH组)。将去势摘除双侧卵巢和腹部皮下注射rh-GH作为不同处理因素,观察第15天和第30天时3组大鼠正畸牙移动引起牙槽骨受压侧破骨细胞数的变化,并进行组织学观察。用SPSS12.0软件包对数据进行完全随机设计资料的方差分析。结果:对3组大鼠不同时间正畸牙牙槽骨受压侧破骨细胞计数进行比较,发现同一时间3组数据的差异有统计学意义(P<0.05);OVX-NS组比OVX-GH组显著增多(P<0.05),对照组最少;同组相比,第15天处死的大鼠与第30天处死的大鼠其破骨细胞数无显著差异(P>0.05);牙周组织学观察见,OVX-GH组牙周膜的损伤和创伤性炎症较OVX-NS组明显减轻。结论:去势(成年)大鼠腹部皮下注射rh-GH,能够减少其正畸牙移动引起的受压侧破骨细胞数目,同时可促进牙周组织因正畸力所致的病理性变化的恢复,对成年正畸治疗有良好的协同作用。

叶黄素对破骨细胞分化的影响

研究叶黄素对体外破骨细胞分化的影响.建立由骨保护素配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)共同细胞因子的小鼠破骨细胞骨髓诱导体系,将不同浓度的叶黄素作用于破骨细胞.受试细胞分为对照组、叶黄素低剂量组(10-8mol/L)、叶黄素中剂量组(10-7mol/L)和叶黄素高剂量组(10-6mol/L),并设立空白对照组.7 d后取细胞玻片进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,观察破骨细胞并计数;取骨片进行甲苯胺蓝染色,光镜下统计骨吸收陷窝面积;测量抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性以及破骨细胞表面NF-κB活化受体(RANK)mRNA表达量.诱导培养的破骨细胞形态特征明显;叶黄素中、高剂量组在细胞数量、TRAP活性上与对照组相比有明显统计学差异(P<0.05);叶黄素各剂量组在(RANK)mRNA表达量上与对照组相比有明显统计学差异(P<0.05),且呈量效关系.研究表明叶黄素可以抑制体外培养的破骨细胞分化.

大鼠后牙牙槽骨吸收模型的建立及破骨细胞的鉴定

目的建立大鼠后牙牙槽骨吸收模型并对破骨细胞(OCs)进行鉴定。方法用3-0丝线结扎大鼠上颌第二磨牙牙颈部并喂以高糖软食,行H-E切片常规组织学观察结扎后牙周组织的变化;应用抗CTR抗体通过免疫组化的方法鉴定OCs。结果大鼠后牙结扎后第3天,结扎部位上皮糜烂,结缔组织见大量炎症细胞浸润,牙槽骨表面出现蚕食状吸收陷窝,第7天以后,结扎部位牙槽骨高度降低。在牙槽骨表面形成的骨吸收陷窝内及附近组织,可见CTR阳性的多核和单核细胞。结论丝线结扎和高糖软食的局部刺激成功地诱导了大鼠牙槽骨破骨细胞性骨吸收。应用抗CTR抗体通过免疫组化的方法鉴定OCs可用于探讨牙槽骨吸收机制的研究。

调节破骨细胞分化的RANK特异性基序的再确认

目的:进一步确认核转录因子NF-κB受体激动剂(RANK)蛋白中调节破骨细胞(OC)分化的特异性基序(motif),为阐明OC分化机制提供理论依据。方法:分别突变RANK蛋白膜内部分第533-540之间的8个氨基酸(突变前氨基酸序列为DIIVVYVS,突变后氨基酸序列为ELLAAFAA),用定点突变方法构建8个由肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和RANK跨膜部分和膜内部分共同组成的TNFR1/RANK突变嵌合体(TNFR1/RANK-533-TNFR1/RANK-540),每1个突变体在其RANK膜内部分含1个突变氨基酸。用包装细胞plat E分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过逆转录病毒感染分别将这些突变体转染到TNFR1/TNFR2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞(BMM)中。用TNF-浕和单核细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激、观察转染哪种突变体的BMM不能诱导OC形成,不能诱导OC形成的突变体所包含的突变前氨基酸就是RANK调节OC分化的关键氨基酸,多个关键氨基酸组成的片段就是RANK特异性motif。结果:转染TNFR1/RANK-533、TNFR1/RANK-539和TNFR1/RANK-540的BMM均能分化成OC,表明氨基酸D533、V539、S540突变后对OC分化无影响;转染TNFR1/RANK-534的BMM有极少数能分化成OC,表明氨基酸I534突变后对OC分化有部分影响;而转染TNFR1/RANK-535、TNFR1/RANK-536、TNFR1/RANK-537和TNFR1/RANK-538的BMM均不能分化成OC,表明氨基酸I535、V536、V537和Y538突变后对OC分化起关键影响。结论:I534、I535、V536、V537和Y538这5个氨基酸组成的片段(534-IIVVY-538)可能就是RANK调节OC分化的特异性motif。

犬乳恒牙替换期间活化T细胞核因子NFATc1表达的研究

目的通过观察犬乳恒牙替换过程中活化T细胞核因子(nuclear factor of active T cells,NFAT)NFATc1的表达探讨其在此过程中的作用及意义。方法制备犬乳恒牙替换各阶段乳牙根、牙槽骨、恒牙胚的组织标本切片,用免疫组织化学方法检测NFATc1在犬乳恒牙替换期间的表达。结果NFATc1在破骨细胞、恒牙胚成釉细胞、成牙本质细胞层中表达阳性。结论NFATc1可能参与了犬乳恒牙替换生理过程中乳牙根、牙槽骨的吸收和恒牙胚的发育。

破骨细胞相关MicroRNA研究进展

MicroRNA(miRNA)是一种非编码蛋白RNA,其长度约为22nt,广泛存在于真核生物细胞中,在生物的生长、发育和疾病发生等生物学过程中发挥着重要作用。随着对miRNA研究的不断深入,其在骨代谢方面的研究也逐渐展开。作为体内唯一一种负责骨吸收的细胞,破骨细胞(OC)在机体骨组织生理及病理性过程中占有重要地位。OC的形成和分化受多种因素调节,研究发现多种miRNA对OC有着调控作用,如miR-21、miR-422a和miR-148a能够促进OC形成,miR-124、miR-155和miR-503则抑制OC形成,除此以外,某些miRNA还能通过OC调控肿瘤骨转移。对这些机制的研究将从另一个层面揭示代谢性骨病的病因,并对临床治疗提供指导。论文对miRNA在OC形成和分化过程中的作用及机制进行综述。

盐酸氨基胍对兔牙扭转过程中牙周组织内破骨细胞的影响

目的:研究盐酸氨基胍(AG)对兔牙扭转移动过程中牙周组织内破骨细胞的影响,并分析其机制。方法:选取36只雄性新西兰大白兔,随机分为2组,建立兔正畸牙扭转移动模型。分别于扭转牙颊侧局部骨膜下注射40mg/mL盐酸氨基胍(AG组)和生理盐水(NaCl组),隔天1次。于加力后第3、7、14、21、28和42天处死动物,取材制作切片,行TRAP酶组织化学和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组织化学染色,观察破骨细胞募集以及iNOS的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:2组破骨细胞募集数量变化趋势具有相似规律。与NaCl组相比,AG组自第14天起破骨细胞募集数量显著降低(P<0.05)。自加力第21天起,AG组牙周组织压力侧iNOS表达的阳性面积百分比显著小于NaCl组(P<0.05)。AG组破骨细胞计数与iNOS阳性表达面积百分比呈正相关(r=0.875,P<0.05)。结论:AG对iNOS的表达有抑制作用,可能是通过减少NO生成而间接抑制破骨细胞的募集。

破骨细胞酸性磷酸酶染色后快速半定量分析

目的寻求合适的溶剂,溶解破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色产物,筛选溶液的最适检测波长,检测溶液吸光度值。比较该方法与TRAP活性检测试剂盒法相关性,并评价该快速半定量分析法的稳定性与可靠性。方法提取C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMMs),以1×10~4·mL^(-1)均匀种入胶原I包被处理24孔板,随机分为4组:10 nmoL/L PTH(1-34),100 nmoL/L PTH(1-34),1μmoL/L PTH(1-34),10μmoL/L PTH(1-34),给予甲状旁腺素[PTH(1-34)]刺激4 h后换成含10%胎牛血清完全培养基培养44 h,以4 h/44 h为1个周期,培养8 d后,进行常规破骨细胞TRAP染色,筛选合适的溶剂溶解,最终使用冰醋酸溶解TRAP原位染色产物,超声粉碎取上清,选取合适的波长检测吸光度(OD)值,此为冰醋酸溶解定量法。另一检测手段为目前常规使用的酶活性检测试剂盒法,试比较冰醋酸溶解定量法与酶活性检测试剂盒法两者的相关性。结果常规破骨细胞原位TRAP染色后,筛选出冰醋酸的溶解效果最优。溶解后测定波长在550 nm左右吸收峰理想,并排除溶剂冰醋酸本身的干扰。随着PTH(1-34)浓度增高,表现出破骨效应的增加,TRAP的活性增加,两者的OD值相应增加。冰醋酸溶解定量法与酶活性检测试剂盒法存在显著正相关,Pearson相关系数r=0.986(P<0.05)。结论采用冰醋酸溶解定量法,并用550 nm波长测定OD值,可实现破骨细胞TRAP染色后的快速半定量分析。