OPG基因敲除小鼠骨质疏松情况的研究

目的研究护骨素(Osteoprotegerin,OPG)基因敲除纯合子小鼠(homozygous OPG knockout mice,OPG-/-mice)骨质疏松发生情况,为OPG-/-小鼠骨质疏松模型的应用提供依据。方法非频密繁殖法获得OPG-/-小鼠,PCR技术进行OPG基因表型鉴定。16周龄OPG-/-子代小鼠和16周OPG野生型小鼠各10只,采用双能X线骨密度测量仪(DEXA)测定全身骨密度(Bone mineral density,BMD)、万能材料试验机测定股骨生物力学强度;骨组织形态计量学分析L5椎体骨小梁结构;实时荧光定量PCR检测L1椎体骨组织中BMP-2、Runx2 mRNA表达水平。结果OPG-/-子代小鼠和亲代纯合子小鼠表现出相同的OPG基因缺失表型。与同龄野生型小鼠比较,16周龄OPG-/-小鼠全身骨密度、股骨承受最大载荷、股骨结构刚度、腰椎椎体骨小梁数目、腰椎椎体骨小梁厚度显著下降(t=5.740,6.069,6.859,6.891,3.558,P<0.01);股骨承受破裂载荷、腰椎椎体骨小梁体积分数下降(t=3.157,3.329,P<0.05);股骨承受载荷后的最大位移、破裂位移显著增加(t=-3.868,-3.276,P<0.01);腰椎椎体骨小梁分离度增加(t=-2.575,P<0.05),腰椎椎体Runx2 mRNA表达升高(t=-3.738,P<0.05);腰椎椎体中BMP-2 mRNA表达升高不明显,差异无统计学意义(t=-1.589,P>0.05)。结论OPG-/-小鼠表现出明显的骨质疏松,是一种理想的骨质疏松模式动物。

补肾法对去卵巢大鼠骨髓细胞OPG、RANKL和TNF-α基因表达的影响

目的观察补肾中药对大鼠去卵巢后骨髓细胞表达核因子κB受体活化子配体(RANKL)、核因子κB受体活化子(RANK)、护骨素(OPG)和肿瘤坏死因子α(TNFα)基因的影响。方法健康3月龄雌性SD大鼠72只,其中24只为假手术对照组,48只去卵巢后随机分为去卵巢组和中药组,每组24只。分别于去卵巢后2、4、6、12周每组各取6只大鼠骨髓细胞提取RNA,RTPCR半定量分析其表达。结果与对照组比较,去卵巢后2周,去卵巢组骨髓细胞TNFα和RANKL的mRNA表达显著升高(P<0.05～0.01),第4～6周,上述改变达高峰,至第12周TNFα仍呈有意义增高;而去卵巢组OPG表达在第2～6周则明显降低,2～4周为最低点。中药组TNFα和RANKL表达低于去卵巢组(P<0.05,P<0.01),而OPG表达明显高于去卵巢组。但是中药治疗未能使以上基因表达完全恢复正常。各组全程未见RANK基因表达水平有明显变化。结论补肾中药在一定程度上抑制去卵巢大鼠骨髓细胞过度表达TNFα和RANKL,同时增加OPG的表达。

雌激素调节大鼠去卵巢后骨髓细胞OPG、RANKL、RANK基因表达

目的观察大鼠去卵巢后骨髓细胞核因子κB受体活化子配体(RANKL)、核因子κB受体活化子(RANK)、护骨素(OPG)以及TNFα基因表达的改变和雌激素的影响。方法健康3m龄雌性SD大鼠72只,24只为假手术对照组,48只去卵巢,随机分为去卵巢组和雌激素组,每组24只。分别于去卵巢后2、4、6、12w每组各取6只大鼠骨髓细胞提取RNA,RTPCR半定量分析其表达。结果与对照组相比,去卵巢后2w,去卵巢组骨髓细胞TNFα和RANKLmRNA表达显著升高(P<0.05～0.01),第4～6w,上述改变达高峰,至第12wTNFα仍呈有意义增高;而OPG表达在第2～6w则明显降低(P<0.01),2～4w为最低点;OPGRANKL比值2～6w为最低(P<0.01),12w仍低于对照组。雌激素组以上各时间TNFα和RANKL表达低于去卵巢组(P<0.05,P<0.01)而OPG表达和OPGRANKL比值明显高于去卵巢组(P<0.01)。各组全程未见RANK基因表达水平有明显变化。结论雌激素抑制大鼠去卵巢后骨髓细胞过度表达RANKL和TNFα而增加OPG的表达。

人骨保护素基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人骨保护素(hOPG)基因的重组腺病毒载体并检测其转染能力。方法采用基因工程技术,将hOPG基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带hOPG基因的重组腺病毒AdEasy-PAdtrack-CMV-hOPG,将重组腺病毒AdhOPG对大鼠骨髓基质细胞(rMSCs) 进行感染。采用PCR方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度。结果酶切鉴定及PCR结果证明hOPG基因重组腺病毒载体成功, 病毒滴度可达2．5×108pfu／ml,具有很强感染能力,结论应用细菌内同源重组法,成功构建了含 hOPG重组腺病毒载体。

联合应用重组人骨保护素和阿伦膦酸钠抑制成熟破骨细胞的体外实验研究

目的研究联合应用重组人骨保护素(rhOPGFc)和阿伦膦酸钠(ALN)对破骨细胞抑制作用。方法进行人类OPGFc融合蛋白毕赤酵母表达株的构建和鉴定。酶消化法获取新生小鼠颅骨成骨细胞,与破骨细胞前体细胞RAW264.7按照4∶1比例混合,培养于96孔板中。9d后,重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色(TRAP染色)鉴定后,分别使用10-5g/LrhOPGFc、10μmol/LALN、10-5g/LrhOPGFc+10μmol/LALN、5×10-6g/LrhOPGFc+5μmol/LALN作用于混合细胞体系,并设空白对照。加药后3、7d观察破骨细胞数目和形态,计算单位面积内TARP阳性细胞个数,并行骨磨片吸收陷窝计数。结果重组人骨保护素(rhOPGFc)分子量与预期结果相符合,蛋白印迹检测(Westernblotting)显示,该条带可被抗免疫球蛋白IgG抗体别显色。小鼠成骨细胞与破骨细胞前体细胞RAW264.7混合培养后9d,体系中出现大量多核成熟破骨细胞,TARP染色证实为成熟破骨细胞。加药3、7d后,与对照组相比,其余各组破骨细胞TARP阳性细胞个数,骨磨片吸收陷窝计数均明显减少,以10-5g/LrhOPGFc+10μmol/LALN组减少最为显著。结论重组人骨保护素(rhOPGFc)可以有效减少成熟破骨细胞数目并抑制其功能。联合应用rhOPGFc和阿伦膦酸钠可以交互抑制成熟破骨细胞功能。

痛风性关节炎骨质疏松患者血清LEP、OPG与IL-6、TNF-α相关性研究

目的分析痛风性关节炎骨质疏松患者血清瘦素(LEP)、骨保护素(OPG)与炎症因子白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)相关性。方法选择痛风性关节炎患者48例为研究对象(GA组),其中伴有骨质疏松19例(OP组),不伴有骨质疏松29例(非OP组),另选择健康体检者45例为对照。以双能X线骨密度吸收仪测定骨密度,ELISA检测血清LEP、OPG及IL-6、TNF-α水平并分析相关性。结果 GA组患者骨质疏松发生率39.6%明显高于对照组的13.3%(P=0.004),各部位骨密度明显低于对照组(P<0.05)。与对照组及非OP组相比,OP组患者血清LEP水平明显升高,OPG水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。非OP组患者血清LEP水平明显高于对照组(P<0.05),但OPG水平差异无统计学意义(P>0.05)。OP组患者血清IL-6、TNF-α水平明显高于非OP组及对照组(P<0.05),非OP组明显高于对照组(P<0.05)。OP组患者血清LEP与IL-6、TNF-α呈正相关(P<0.05),血清OPG与IL-6、TNF-α呈负相关(P<0.05)。结论痛风性关节炎伴发骨质疏松患者血清LEP、OPG呈异常变化,其与IL-6、TNF-α有一定相关性。