基于Runx2/Osterix信号通路探讨自拟益肾接骨汤对胫骨骨折非感染性骨不连患者骨代谢的影响

目的:基于Runx2/Osterix通路探讨自拟益肾接骨汤治疗胫骨骨折非感染性骨不连患者的疗效及其对骨代谢的影响。方法:选取开封市人民医院2021年9月—2023年5月收治的胫骨骨折非感染性骨不连患者80例为研究对象,依据治疗方式的不同分为对照组和研究组各40例。对照组给予常规治疗,研究组在对照组基础上给予自拟益肾接骨汤治疗,经治12周后比较两组患者骨痂生长情况,骨代谢指标,Runx2/Osterix通路相关分子表达。结果:研究组治疗12周、24周后Fenradez-esteve评分高于对照组(P<0.05);两组治疗12周后BALP/ALP水平较治疗前升高(P<0.05),且研究组高于对照组(P<0.05);两组β-CTX水平较治疗前降低(P<0.05),且研究组低于对照组(P<0.05)。两组治疗12周后Runx2、Osterix水平较治疗前升高(P<0.05),且研究组高于对照组(P<0.05)。结论:自拟益肾接骨汤可调节胫骨骨折非感染性骨不连患者Runx2/Osterix通路相关分子表达,调控骨代谢,促进骨痂生长。

基于“髓系骨病”理论探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用

目的:探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用。方法:Osterix-CreERT2小鼠(Osterix基因靶标小鼠)与Rosa26-tdTomato小鼠(番茄红荧光报告小鼠)交配获得子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠,Osterix-CreERT2小鼠与Rosa26-DTA小鼠(白喉毒素A片段报告小鼠)交配获得子代Rosa26-DTA小鼠和Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠。选取3只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠纳入示踪组,6只子代Rosa26-DTA小鼠纳入空白组,6只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠纳入Osterix阳性细胞剔除组。各组小鼠均于1月龄时按0.1 mg·g^(-1)体质量腹腔注射他莫昔芬,每天1次,连续注射5 d,以诱导白喉毒素表达,特异性剔除Osterix阳性细胞。他莫昔芬干预结束后2周,脱颈处死示踪组小鼠,切取左侧股骨,通过免疫荧光染色观察Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况。他莫昔芬干预结束后6个月,脱颈处死Osterix阳性细胞剔除组和空白组小鼠,切取左侧股骨,以Micro-CT观察小鼠股骨骨微结构、阿尔新蓝-苏木精染色观察小鼠股骨组织形态、免疫组织化学染色测定小鼠股骨中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein,FABP4)表达量。结果:①Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况。Osterix阳性细胞中tdTomato蛋白的红色荧光与DAPI染色的细胞核蓝色荧光分布高度重合,均位于髓腔;Osterix阳性细胞中tdTomato蛋白的红色荧光与CD73染色的骨髓间充质干细胞细胞核绿色荧光分布高度重合,均位于髓腔。②小鼠股骨骨微结构观察结果。Osterix阳性细胞剔除组的骨松质骨密度和骨松质骨小梁厚度均低于空白组[(36.077±3.449)g·mm^(-3),(25.240±1.077)g·mm^(-3),t=2.831,P=0.031;(0.070±0.004)mm,(0.055±0.003)mm,t=2.839,P=0.014],骨松质骨小梁分离度高于空白组[(0.332±0.012)mm,(0.381±0.004)mm,t=-2.159,P=0.009];2组的骨松质骨体积分数、骨松质骨小梁数量比较,组间差异均无统计学意义[(6.902±2.216)%,(2.531±0.399)%,t=1.848,P=0.129;(0.950±0.266)个·mm^(-1),(0.418±0.037)个·mm^(-1),t=1.626,P=0.122]。Osterix阳性细胞剔除组的骨皮质骨密度、骨皮质骨体积分数、骨皮质骨小梁厚度均低于空白组[(40.127±1.718)g·mm^(-3),(24.990±3.099)g·mm^(-3),t=4.522,P=0.003;(19.482±0.803)%,(13.444±1.604)%,t=3.600,P=0.009;(0.161±0.006)mm,(0.117±0.010)mm,t=3.818,P=0.007];2组的骨皮质骨小梁分离度、骨皮质骨小梁数量比较,组间差异均无统计学意义[(0.295±0.001)mm,(0.296±0.003)mm,t=-0.372,P=0.072;(1.124±0.221)个·mm^(-1),(1.146±0.042)个·mm^(-1),t=1.525,P=0.171]。③小鼠股骨组织形态观察结果。与空白组相比,Osterix阳性细胞剔除组小鼠股骨生长板软骨-骨连接处有大量脂滴生成,脂肪空泡堆积。Osterix阳性细胞剔除组的脂滴面积大于空白组[(203.514±0.957)%,(241.061±5.805)%,t=-6.381,P=0.003]。④小鼠股骨中ALP和FABP4表达量测定结果。Osterix阳性细胞剔除组股骨ALP表达量低于空白组[(1.143±0.122)%,(0.550±0.641)%,t=4.305,P=0.013],FABP4表达量高于空白组[(10.419±1.113)%,(15.670±1.405)%,t=-2.930,P=0.043]。结论:Osterix阳性骨髓间充质干细胞发挥着维持骨稳态的作用。

桃红四物汤对创伤性股骨头坏死模型大鼠骨组织BMP-4和Osterix表达的影响

目的:通过检测桃红四物汤对创伤性股骨头坏死(trauma-induced osteonecrosis of the femoral head,TIONFH)模型大鼠骨组织BMP-4和Osterix表达的影响,探讨桃红四物汤延缓TIONFH病程的作用机制。方法:将35只SD大鼠适应性喂养1周后随机分为空白组(7只)和造模组(28只)。造模组按照经典股骨头血供剥离法进行造模,造模4周后随机抽取空白组1只、造模组4只进行对比,确认造模成功后,将造模组随机分为桃红四物汤高、中、低剂量组及模型组,共4组,每组6只。依据人与动物体表面积换算公式,桃红四物汤组分别灌服相应剂量的汤剂,另外两组灌服等量0.9%氯化钠注射液,每日2次,持续6周。干预6周后取材,观察并记录股骨头大体形态,进行骨组织HE染色,采用Real-time-PCR法和Western Blot法分别检测股骨头组织中BMP-4和Osterix的基因和蛋白表达情况。结果:经桃红四物汤干预后,桃红四物汤高、中剂量组股骨头病理情况优于模型组,次于空白组。Western Blot结果显示,与空白组比较,模型组大鼠股骨头组织BMP-4、Osterix蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,桃红四物汤各剂量组BMP-4蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),桃红四物汤高、中剂量组Osterix蛋白表达水平明显升高(P<0.01),桃红四物汤低剂量组Osterix蛋白表达水平与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Real-time-PCR结果显示,与空白组比较,模型组大鼠股骨头组织BMP-4、Osterix mRNA表达量明显降低(P<0.01);与模型组比较,桃红四物汤高、中剂量组BMP-4、Osterix mRNA表达量明显升高(P<0.01);桃红四物汤低剂量组BMP-4、Osterix mRNA表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:桃红四物汤能改善股骨头病理形态,其机制可能与桃红四物汤提高成骨相关因子BMP-4、Osterix的表达从而促进骨修复有关。

加减知柏地黄丸对特发性中枢性性早熟小鼠ERK1/2、OSX表达的影响

目的探讨加减知柏地黄丸对特发性中枢性性早熟(ICPP)小鼠细胞外信号调控激酶(ERK1/2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)表达的影响。方法将30只18日龄雌性SPF级C57小鼠随机分为正常组、模型组、加减知柏地黄丸高剂量组、加减知柏地黄丸低剂量组、甲地孕酮组和抑那通组,每组5只。在小鼠20日龄时,正常组给予生理盐水腹腔注射,其余组小鼠腹腔注射瘦素2 mg/kg建立ICPP模型。同时加减知柏地黄丸高、低剂量组分别给予加减知柏地黄丸水溶液3.9 g/mL、1.95 g/mL灌胃,甲地孕酮组给予甲地孕酮水溶液0.13 mg/mL灌胃,正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,均1次/d,连续7 d;抑那通组分别于20日龄、22日龄和24日龄时依次给予抑那通1.574 mg/kg、1.180 mg/kg、1.180 mg/kg右后肢处肌注。实验结束后,qRT-PCR法检测股骨组织中ERK1、ERK2和OSX mRNA表达情况,Western blot法检测股骨组织中ERK1、ERK2表达情况,ELISA法检测血清骨生化指标[胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碱性磷酸酶(ALP)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)、N端中段骨钙素(N-MID)]水平。结果模型组股骨组织中ERK1、ERK2、OSX mRNA表达量和ERK1、ERK2蛋白表达量及血清IGF-1、ALP、OCT、N-MID水平均明显高于正常组(P均<0.05),加减知柏地黄丸高剂量组、加减知柏地黄丸低剂量组、甲地孕酮组股骨组织中ERK1、ERK2、OSX mRNA表达量和ERK1、ERK2蛋白表达量及血清IGF-1、ALP、OCT、N-MID水平均明显低于模型组(P均<0.05)。结论加减知柏地黄丸能通过抑制ERK1/2表达,抑制成骨细胞生长和分化成熟,从而延缓ICPP小鼠骨骺提前闭合。

BMP-2/Smads/Osterix信号在氟化钠诱导大鼠成骨细胞增殖分化中的作用研究

目的探讨氟化钠对大鼠颅骨成骨细胞增殖分化的影响,并进一步研究BMP-2/Smads/Osterix信号的调控机制。方法选择新生SD大鼠(24 h以内)颅骨,分离大鼠颅骨中的成骨细胞,进行体外原代培养。分别用不同浓度的氟化钠作用于成骨细胞,用噻唑蓝(MTT)、碱性磷酸酶观察氟化钠对大鼠成骨细胞的影响,并用蛋白印迹法测定BMP-2蛋白、Smad1/5/9蛋白、Osterix蛋白的表达。结果与对照组相比,低剂量的氟化钠(0.25mmol/L、0.50 mmol/L)暴露于成骨细胞,成骨细胞增殖明显、碱性磷酸酶活性增强,而当高剂量的氟化钠(2.00mmol/L、4.00 mmol/L)刺激成骨细胞,成骨细胞的增殖明显受到抑制、碱性磷酸酶活性降低;与对照组比较,低剂量氟化钠浓度为0.50 mmol/L时,BMP-2蛋白、Smad1/5/9蛋白、Osterix蛋白的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低浓度氟化钠可通过BMP-2/Smads/Osterix信号促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,高浓度氟化钠则抑制成骨细胞的增殖分化。

苗药九仙罗汉接骨汤含药血清对MC3T3-E1Subclone14细胞增殖、凋亡和Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2表达的影响

目的:观察苗药九仙罗汉接骨汤含药血清对MC3T3-E1Subclone14细胞增殖、凋亡及Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响,探讨其促进成骨细胞增殖,抑制成骨细胞凋亡的可能机制。方法:将体外培养的MC3T3-E1Subclone14细胞系分为空白对照组、仙灵骨葆胶囊组及九仙罗汉接骨汤含药血清低、中、高浓度组,各组制备含药血清后均用高糖DMEM培养液分别配制成不同浓度进行培养;培养24 h后采用MTT与流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡;RT-PCR与Western Blot、免疫组化法测定Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表达。结果:与空白对照组比较,九仙罗汉接骨汤含药血清中、高浓度组增殖能力显著升高,细胞凋亡率显著降低,Runx2、Osterix、Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著升高,Bax mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:苗药九仙罗汉接骨汤可促进MC3T3-E1Subclone14细胞增殖,并抑制其凋亡,其作用机制可能与调节Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2基因及蛋白表达有关。

加减知柏地黄丸对特发性中枢性性早熟小鼠Runx2、OSX表达的影响

目的:观察加减知柏地黄丸对特发性中枢性性早熟(ICPP)小鼠核心结合蛋白因子2(Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)的影响,探讨加减知柏地黄丸治疗ICPP缓解骨骺提前融合的作用机制。方法:本实验采用腹腔注射瘦素(Leptin)(2 mg/kg)SPF级雌性C57小鼠复制特发性中枢性性早熟(ICPP)模型,将小鼠随机分成6组:正常对照组、ICPP模型对照组、加减知柏地黄丸高剂量组、加减知柏地黄丸低剂量组、甲地孕酮对照组、GnRH-A组。正常雌性小鼠阴道开口时间一般在日龄26~28 d,以27 d较为集中,因此设计为小鼠26 d日龄时结束实验;小鼠实验结束前1 d,ELISA检测骨生化指标碱性磷酸酶(ALP)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、N-MID骨钙素片段(N-MID)和激素黄体生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH),Real-Time PCR、Western blot检测Runx2、OSX在ICPP骨组织中的表达水平。结果:与正常组比较,ICPP模型组骨生化指标ALP、IGF-1、N-MID以及激素LH和FSH浓度明显升高(P<0.01),Runx2、OSX表达水平明显增高(P<0.01)。与模型组比较,加减知柏地黄丸和甲地孕酮对照组可以明显下调ALP、IGF-1、N-MID和激素LH和FSH浓度,以及RUNX2、OSX表达水平(P<0.05,P<0.01),并与加减知柏地黄丸剂量相关。结论:加减知柏地黄丸是通过作用于Runx2、OSX骨信号通路,改变血清中骨相关指标和激素的水平,来减慢骨龄的进展,缓解骨骺提前融合。

Runx2参与调控Osterix启动子活性及其基因表达(英文)

尽管Runx2和Osterix都是成骨细胞分化途径中关键的转录因子,但是Runx2是否能够调控Osterix,还不为所知.研究发现,在非成骨细胞系,无论是间充质干细胞还是已分化的细胞,以及成骨细胞系中,Runx2都能诱导Osterix的表达.同时Runx2能够上调3.2kb人的Osterix基因启动子活性.进一步实验证明,在这一段启动子中存在Runx2功能性的结合位点.因而,实验结果有力地支持了这样一个假设,即Runx2参与了Osterix基因的表达调控.瞬时转染和荧光素酶双报告分析结果显示,在非成骨细胞中,Osterix明显上调2.3kb的Ⅰ型胶原蛋白启动子活性,但Runx2却不能.这样的差别暗示,在成骨细胞分化过程中位于Runx2下游的转录因子Osterix是刺激Ⅰ型胶原蛋白基因表达所必需的.

补肾活血汤调控Runx2及Osterix促进BMSCs成骨分化的作用研究

目的:探讨补肾活血汤提高骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal cells,BMSCs)Runx2及Osterix基因表达,促进成骨分化的作用。方法:从双侧股骨和胫骨分离大鼠BMSCs并使用腺病毒载体转染BMSCs细胞,构建过表达Runx2细胞株,Q-PCR法对转染细胞株进行鉴定,CCK8法评价补肾活血汤对BMSCs活性的影响,ALP半定量活性检测法评价补肾活血汤对BMSCs成骨分化的影响,RT-PCR、Western Blot法检测补肾活血汤对成骨相关标志物Runx2和Osterix表达量的影响。结果:成功构建过表达Runx2的BMSCs细胞,补肾活血汤组在25μg/m-200μg/ml之内对细胞活性没有影响,与正常培养组比较补肾活血汤100μg/ml组ALP活性显著提高,与正常培养组比较补肾活血汤50μg/ml、100μg/ml组Runx2和Osterix的mRNA和蛋白相对表达量显著增加。结论:补肾活血汤能提高BMSCs中Runx2和Osterix的表达,促进成骨分化。

淫羊藿对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化过程中Cbfa1和Osterix表达的影响

目的:研究淫羊藿对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化过程中Cbfa1和Osterix表达的影响。方法:24只雌性SD大鼠被随机分成观察组和对照组各12只,其中观察组给予淫羊藿0.5 g/0.1 kg,每天1次灌胃,持续两周;对照组给予相同剂量的生理盐水。于分组时间将大鼠处死,取右侧股骨远侧段用于骨组织形态计量学检测;抽取左侧股骨骨髓用于细胞培养,于培养21 d时提取细胞总RNA,经PCR方法分离获得cbfa1,osterix扩增产物。结果两组大鼠的骨形态计量学进行比较,观察结果表明,观察组大鼠骨组织计量学动态参数以及静态参数BV/TV、BFR/BS、tb.th、MAR比着对照组明显要高,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组大鼠的Cbfa1,Cbfb和OSX m RNA表达的差异比较,研究组Cb fa1 m RNA,OSX m RNA在各时间点的表达均明显增加(P<0.05),并且这种差异随SIM作用时间增加而增强,研究组与对照组Cbfbm RNA差异无统计学意义(P>0.05)两组大鼠的骨形态蛋白-2以及转化因子β1相比,骨形态蛋白-2观察组明显高于对照组,差异存在统计学意义(P<0.05),转化因子β1比较观察组明显高于对照组,差异存在统计学意义(P<0.05)。结论:骨组织形态计量学方法显示淫羊藿组促进骨量增加;细胞分子生物学显示淫羊藿能够促进成骨细胞分化增殖作用,为中药抗骨质疏松提供组织细胞和分子生物学基础证据。

基于骨组织Runx2、Osterix启动子甲基化探究鹿茸中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠的疗效机制

目的基于骨组织Runx2、Osterix启动子甲基化水平,探究鹿茸中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠的疗效机制。方法去卵巢复制绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMOP)大鼠模型,将其分4组,分别为:正常组、模型组、鹿茸中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组。灌胃14周后,X射线吸收测量法检测骨密度、质谱法检测Runx2、Osterix启动子甲基化水平。结果(1)与正常组比较,模型组第1~6腰椎骨密度明显降低(P<0.01);骨组织Runx2启动子-955 bp^-456 bp CpG1、CpG2甲基化水平明显升高(P<0.05);骨组织Osterix启动子-1082 bp^-583 bp CpG1、CpG2甲基化水平明显升高(P<0.01)。(2)与模型组比较,鹿茸中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组第1~6腰椎骨密度明显升高(P<0.05);鹿茸中药复方组骨组织Runx2启动子-955 bp^-456 bp CpG1、CpG3甲基化水平明显降低(P<0.05),Osterix启动子-1082 bp^-583bp CpG1甲基化水平明显降低(P<0.05);仙灵骨葆阳性对照组骨组织Runx2启动子-955 bp^-456 bp CpG1、CpG2甲基化水平明显降低(P<0.05),Osterix启动子-1082 bp^-583 bp CpG1、CpG2甲基化水平明显降低(P<0.01)。结论鹿茸中药复方通过降低骨组织Runx2、Osterix启动子甲基化水平的表观遗传学机制,有效防治PMOP。

补肾中药成分配伍调控RUNX2、OSX对大鼠BMSCs成骨分化的影响

目的观察补肾代表中药淫羊藿、补骨脂、女贞子、何首乌有效成分对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及向成骨细胞定向分化的影响。方法将65只SPF级SD雌性大鼠随机分为正常对照组、阳性转化液对照组、补肾中药配伍组(补肾中药1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组)、非补肾中药对照组(黄芪甲苷组、川芎嗪组)。通过血清药理学方法,对实验大鼠连续灌胃给药3 d后,取材获得含药血清,使用各组大鼠含药血清培养骨髓间充质干细胞6 d、12 d、18 d;用茜素红染色对钙化结节进行成骨细胞鉴定;应用MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖率,酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,用实时定量PCR法检测核心结合蛋白因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)的基因表达。结果补肾中药有效成分不同配伍含药血清作用于体外培养骨髓间充质干细胞72 h,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖。ALP在12 d达到高峰值。Real-Time PCR结果显示补肾中药有效成分能上调RUNX2、OSX的基因表达。结论补肾中药有效成分配伍能提高骨髓间充质干细胞增殖率,促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,其机制与补肾中药有效成分配伍能上调RUNX2、OSX的基因表达相关。

骨形态发生蛋白2通过Smad途径上调Osterix的表达

Osterix(Osx)是一种重要的调控成骨细胞分化的具有锌指结构的转录因子.骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP 2)能够上调Osx的表达,但其分子机制并不清楚.采用实时定量RT-PCR方法检测到BMP2诱导成骨相关细胞C3H10T1/2,MC3T3-E1,C2C12中Osx的转录水平显著上调,并且与成骨分化指标Col1a1,osteocalcin具有相似的表达动力学特征.而且,在C3H10T1/2细胞中过表达负显性(dominant negative,DN)Osx基因,能够有效抑制BMP2诱导的成骨分化.过表达BMP/Smad信号通路抑制蛋白Smad6,能够抑制Osx转录水平的上调.但是通过荧光素酶报告载体对Osx的启动子-1254^+85区域进行分析后未发现接受BMP通路调控的启动子区域.上述结果表明,BMP2能够通过Smad途径上调Osx的表达,并对成骨分化的过程具有十分重要的作用.

神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化

目的研究神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子途径。方法分离骨髓基质干细胞进行原代及传代培养；分别采用空白对照、P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质＋P物质NK1受体拮抗剂进行干预，诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；传代培养1～2周后，抽提细胞总RNA，用RT-PCR检测分化过程中Osterix基因的表达。检测结果重复3次，采用单因素方差分析检测结果。结果骨髓基质干细胞在生长对数增殖期为4～6d，采用RT-PCR检测发现P物质干预成骨细胞分化，导致成骨细胞分化过程中重要的转录引子Osterix基因表达，与其他各组比较有显著差异（P〈0．05），Osterix基因表达上调，从而刺激前成骨细胞向成骨细胞转化。而P物质＋P物质NK，受体拮抗剂共同干预，Osterix基因表达与空白对照组无显著差异（P〈0．05），说明P物质通过P物质NK，受体对成骨细胞分化进行调控。结论P物质可调控前成骨细胞分化过程中转录因子Osterix基因表达促进其向成骨细胞分化。P物质对Osterix基因表达的调控依赖P物质NK1受体。

淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ通过BMP/Runx2/Osx信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的观察淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化过程中BMP-2/Runx2/Osx信号通路的影响,探讨其可能的作用机制。方法贴壁筛选法体外培养BMSCs,随机分为空白对照组、阳性转化液组、抑制剂组、淫羊藿次苷Ⅰ组及淫羊藿次苷Ⅰ+抑制剂组、淫羊藿次苷Ⅱ组及淫羊藿次苷Ⅱ+抑制剂组。通过茜素红染色,对各组促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化作用进行药效学评价; ELISA法检测各组ALP活性、BGP、COL-Ⅰ、BMP2蛋白分泌量;RTReal-TimePCR法检测各组ALP、BGP、Osterix和Runx-2 mRNA基因表达。结果茜素红染色结果表明,淫羊藿次苷Ⅰ组及淫羊藿次苷Ⅱ组均可明显观察到大量的矿化结节的形成;ELISA实验结果表明,与空白对照组比较,淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均能明显促进ALP细胞活性及BGP、COL-Ⅰ、BMP-2蛋白分泌量,并且差异具有统计学意义(P<0.05);两组药物作用强度均已达到阳性转化液组的80%以上。同时,淫羊藿次苷Ⅰ对ALP活性、 BGP蛋白表达均明显强于淫羊藿次苷Ⅱ,并且差异具有统计学意义(P<0.05);对COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表达量,两者差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR实验结果表明,与空白对照组相比,淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均可显著上调成骨相关转录因子ALP、BGP、RunX2,并进一步调节其下游基因Osterix的转录表达,差异具有统计学意义(P<0.05);与阳性对照液组比较,淫羊藿次苷Ⅱ对ALP、Osterix的mRNA表达无明显差异(P>0.05);淫羊藿次苷Ⅰ与淫羊藿次苷Ⅱ组比较,淫羊藿次苷Ⅱ对Osterix mRNA的表达明显强于淫羊藿次苷Ⅰ,并且差异具有统计学意义(P<0.05)。对ALP、BGP、RunX2 mRNA的表达二者无显著性差异(P>0.05)。结论淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ均能促进BMSCs定向成骨转化,其作用机制可能与激活BMP/Runx2/Osx信号通路有关。淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ作用差异可能与淫羊藿次苷Ⅰ在体内生物转化为淫羊藿次苷Ⅱ有关。

Osterix在调控脊柱发育中的作用

目的观察核转录因子Osterix在脊柱发育中的作用。方法采用Lox P/Cre系统,以2.3 kbⅠ型胶原蛋白为启动子,在小鼠成骨细胞和骨细胞中特异性敲除Osterix,观察Osterix敲除小鼠大体情况,采用X线摄片、HE染色和Nissl染色观察其对小鼠脊柱发育的影响。结果 Osterix敲除小鼠后肢瘫痪,行走时前肢运动正常,拖动后肢爬行,Osterix的敲除效率约为75%;X线片结果显示,Osterix敲除小鼠形体变小,胸腰段脊柱出现楔形椎体、严重的脊柱侧弯和椎管狭窄等畸形;HE染色结果显示胸腰段脊椎结构发育严重异常;Nissl染色结果显示,受累节段脊髓神经元结构严重受损。结论 Osterix在脊柱发育中起到重要作用,敲除后可导致脊柱侧弯等畸形。

淫羊藿素通过BMP/Runx2/Osx信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的观察淫羊藿素对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中BMP/Runx2/Osx信号通路的影响,探讨其可能的作用机制。方法贴壁筛选法体外培养BMSCs,随机分为空白对照组、阳性转化液组、抑制剂组、淫羊藿素组及淫羊藿素+抑制剂组。ELISA法检测各组ALP活性、BGP、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-9蛋白分泌量;RTReal-TimePCR法检测各组ALP、BGP、Osterix和Runx2 mRNA基因表达。结果ELISA实验结果表明,淫羊藿素能促进ALP细胞活性,促进BGP、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-9的蛋白表达,且随着干预时间延长而呈上升趋势。RT-PCR结果显示,淫羊藿素可显著上调成骨相关转录因子ALP、BGP,Runx2及Osterix的转录表达,与空白对照组比较差异显著(P<0.05);与阳性对照液组比较差异显著(P<0.05),但其活性较强。结论淫羊藿素能促进BMSCs定向成骨转化,其作用机制可能与激活BMP/Runx2/Osx信号通路有关。

Runx2、Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨

目的:探讨Runx2和Osterix(OSX)过表达对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)成骨分化的调控作用。方法:通过慢病毒载体,将Runx2和Osterix基因分别转染入HUVECs。通过碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量活性检测,探讨过表达Runx2和Osterix对HUVECs成骨分化的影响。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色检测成骨相关标志物Runx2、OSX、ALP、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)在HUVECs中的表达。采用Graph Pad Prism 6.01软件包对数据进行统计学分析。结果:Runx2过表达有利于HUVECs的成骨分化,而Osterix过表达则无此作用。HUVECs转染Runx2过表达慢病毒后,成骨相关基因Runx2、OSX、ALP、BSP、OPN及OCN的转录水平上调,同时Runx2、OSX、OPN及OCN的蛋白表达水平亦有所上调。结论:Runx2过表达可促进HUVECs的成骨分化。

淫羊藿甙对大鼠成骨细胞功能及Osterix表达的影响

目的观察淫羊藿甙对体外培养成骨细胞功能及Osterix(Osx)表达的影响,探讨淫羊藿抗骨质疏松的作用机制。方法分别用酶消化法获得新生SD大鼠成骨细胞,在培养液中分别加入不同浓度的淫羊藿甙,观察成骨细胞的增殖功能和分化功能。用RTPCR法测定成骨细胞OsxmRNA表达。结果增殖率测定淫羊藿甙从1ng/ml起光密度值均较对照组增加,且呈剂量依赖关系。但仅有浓度为100ng/ml时差异才有显著意义(P<0.01);碱性磷酸酶活性从1ng/ml起均较对照组增加,也呈剂量依赖关系,且浓度≥10ng/ml差异有显著意义;1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml淫羊藿甙均可促进OsxmRNA表达(P<0.05),以10ng/ml组作用最显著。结论淫羊藿甙能通过影响成骨细胞增殖、分化、提高成骨细胞Osx基因表达水平,从而促进骨形成,发挥抗骨质疏松的作用。

全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠腰椎转录因子Osterix蛋白表达的影响

目的:观察全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠腰椎转录因子Osterix蛋白表达的影响,探讨全身垂直振动治疗绝经后骨质疏松的作用机制。方法:将36只3月龄健康雌性未孕SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、去卵巢静止组(OVX组)和去卵巢振动组(WBV组),每组12只。手术后10周,WBV组开始接受全身垂直振动治疗。振动频率90 Hz,重力加速度3.8 g,振幅0.5 mm,每天2次,每次15 min,每周7天,振动7周。振动结束后,腹主动脉取血处死各大鼠,按解剖位置分离第2腰椎(L2)和第3腰椎(L3)。用HE染色观察L2组织形态学变化;用TRAP染色法对L2石蜡切片破骨细胞进行染色并计数;用免疫组化检测L2转录因子Osterix定位变化;用Western blot检测L3转录因子Osterix蛋白表达水平的变化。结果:与Sham组和WBV组比较,OVX组大鼠腰椎骨髓腔脂肪空泡数目、骨小梁表面破骨细胞数目显著增加,而转录因子Osterix蛋白表达显著下降。结论:全身垂直振动能降低去卵巢骨质疏松大鼠腰椎破骨细胞的数目,增强腰椎转录因子Osterix蛋白的表达。