OSTP增强紫杉醇诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用

目的研究卵巢癌特异性结合肽(OSTP)及联合紫杉醇对卵巢癌A2780细胞生长及凋亡的影响。方法体外培养卵巢癌A2780细胞,随机分为4组:溶剂对照组(1640和0.1%DMSO组)、OSTP组、紫杉醇组、OSTP联合紫杉醇组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测OSTP对A2780细胞生长的影响;用Annexin-V-FITC和PI双染法标记A2780细胞,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 MTT法检测OSTP以不同浓度作用于卵巢癌A2780细胞时,可对该细胞的生长起到抑制作用,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。应用流式细胞技术检测细胞凋亡发现:不同浓度的OSTP(20、40、80、160、320μmol/L)对A2780细胞的凋亡率分别7.88%、8.348%、8.727%、9.393%和10.68%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),提示OSTP可诱导细胞凋亡。OSTP和紫杉醇联合应用,在不同的预处理组(加OSTP80μmol/L 0、3、6、12h)后再加紫杉醇10μmol/L作用48h,结果发现细胞凋亡率分别是39.40%、53.09%、48.18%和45.62%,均高于OSTP和紫杉醇单独用药及两者的凋亡率相加值,且差异有统计学意义(P<0.001)。提示OSTP能增强紫杉醇诱导的卵巢癌A2780细胞凋亡作用。结论 OSTP对卵巢癌A2780细胞有生长抑制及凋亡作用,尤其是OSTP能增强紫杉醇诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用,对于探讨和开发OSTP作为靶向化疗增敏剂治疗卵巢癌有良好的应用前景。

OSTP-DDP靶向抑制卵巢癌A2780细胞生长作用的研究

目的研究卵巢癌特异性结合肽(ovarian cancer specific targeting peptide,OSTP)与顺铂(cis-dichlorodiamineplatinum,DDP)偶联物(OSTP-DDP)对卵巢癌A2780细胞的靶向抑制作用。方法化学合成OSTP-DDP,体外培养卵巢癌A2780细胞,采用CCK-8法分别检测OSTP-DDP和DDP对卵巢癌A2780细胞的生长抑制作用;通过Annexin V-FITC凋亡试剂盒分别检测OSTP-DDP和DDP对卵巢癌A2780细胞的周期和凋亡作用。结果通过质谱分析和高效液相色谱(HPLC)分析,提示成功合成OSTP-DDP。CCK-8法检测显示,OSTP-DDP与DDP分别以不同浓度(10、20、40、80、160、320μmol·L^(-1))处理卵巢癌A2780细胞24、48、72 h后,均可对该细胞的生长起到抑制作用,且呈时间、浓度依赖性。且OSTP-DDP的作用强于DDP(P<0.05),提示OSTP-DDP具有靶向抑制细胞生长作用。流式细胞术检测结果显示,经OSTP-DDP和DDP处理后,细胞周期均被阻滞于G_1期,作用72 h后,OSTP-DDP对卵巢癌A2780细胞的周期抑制作用强于DDP,差异具有统计学意义(P<0.05)。作用24、48、72 h后,OSTP-DDP对卵巢癌A2780细胞凋亡的作用强于DDP(P<0.01)差异具有统计学意义,提示OSTP-DDP具有较强的靶向诱导细胞凋亡作用。结论 OSTP-DDP对卵巢癌A2780细胞的生长具有靶向抑制作用,OSTP作为化疗药物靶向载体治疗卵巢癌有良好的应用前景。

卵巢癌特异性结合肽OSTP的鉴定

目的验证卵巢癌特异性结合肽(OSTP)对卵巢癌A2780细胞的特异性结合作用。方法合成OSTP并标记荧光素5-FAM。将培养的卵巢癌A2780细胞及对照组胃癌SGC7901细胞、骨肉瘤MG63细胞分别加5-FAM-OSTP孵育,荧光显微镜下观察拍照。构建卵巢癌A2780细胞荷瘤小鼠模型,尾静脉注入5-FAM-OSTP,循环1 h后进行左心室灌注,取肿瘤组织及各脏器组织,行冰冻切片,荧光显微镜下观察拍照。结果成功合成和标记5-FAM-OSTP。荧光显微镜观察显示:5-FAM-OSTP孵育后的卵巢癌A2780细胞产生明亮的黄绿色荧光,而对照组SGC7901、MG63细胞不产生荧光。裸鼠体内实验结果显示:肿瘤组织可见强荧光信号,平均荧光强度为17.656±1.980;肝组织平均荧光强度4.277±0.291;肾组织平均荧光强度4.422±0.767;其他脏器均无可见荧光信号。肿瘤组织与肝、肾组织的荧光强度间差异有显著性(P<0.05)。结论通过体内外实验证实了5-FAM-OSTP对卵巢癌A2780细胞具有特异结合作用,有望成为卵巢癌靶向化疗药物的导向肽。

乳腺癌特异性多肽介导的HSV-TK/GCV系统的构建及其靶向杀伤效应

目的:研究乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外靶向杀伤作用。方法:以PCR从质粒pORF-HSV-TK中扩增目的基因PI-TK,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-PI-TK载体,转化宿主菌,经IPTG诱导表达PI-TK融合蛋白,利用His-Tag对其进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白。将不同质量浓度的PI-TK融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,联合更昔洛韦(ganci-clovier,GCV)作用后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8法检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-PI-TK,获得纯化的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE及Western blotting鉴定PI-TK融合蛋白表达正确。单独PI-TK融合蛋白不影响MDA-MB-231细胞的形态和增殖,但PI-TK融合蛋白联合GCV能剂量依赖性靶向抑制MDA-MB-231细胞的增殖,200μg/ml PI-TK+10 mg/LGCV作用的抑制率达(68.9±7.57)%;PI-TK联合GCV抑制MDA-MB-231细胞的IC50值为152.64μg/ml。上述各作用对MDA-MB-435细胞均无影响(P<0.05)。结论:乳腺癌特异性转导多肽PI介导的HSV-TK/GCV抗瘤系统可靶向杀伤MDA-MB-231细胞。

光学分子探针FITC-CSPLNTRFC对乳腺癌细胞Bcap-37的特异性和靶向性

目的研究光学分子探针FITC-BCSP1对乳腺癌细胞Bcap-37的特异性和靶向性。方法固相合成法制备探针FITC-BCSP1和阴性对照探针FITC-svBCSP1。MTT法检测两种探针对乳腺癌Bcap-37细胞的毒性。流式细胞术和荧光倒置显微镜鉴定FITC-BCSP1与Bcap-37细胞结合的特异性。光学分子成像仪验证FITC-BCSP1对Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型移植瘤的特异性和靶向性。结果质谱和高效液相色谱法鉴定,所合成探针纯度≥98%。探针FITC-BCSP1和对照探针FITC-svBCSP1在50~300μmol/L浓度内对Bcap-37细胞增殖、活性无影响(IR%≤30%)。流式细胞术显示Bcap-37细胞中FITC-BCSP1标记的细胞百分比明显高于其他细胞(均P<0.001);FITC-BCSP1标记的Bcap-37细胞百分比明显高于对照组(P<0.001)。荧光倒置显微镜下观察到,FITC-BCSP1标记Bcap-37细胞中有大量荧光细胞,阳性率为100%,而FITC-svBCSP1组阳性率仅1%。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示,FITC-BCSP1能特异性富集在移植瘤组织。结论光学分子探针FITC-BCSP1有良好的乳腺癌细胞特异性及靶向性,可用于乳腺癌早期诊断研究。

人卵巢癌细胞靶向多肽的筛选与初步鉴定

采用改良的生物淘筛(Biopanning)流程,以人卵巢癌细胞为靶细胞进行5轮消减筛选,从噬菌体展示12肽文库(Ph.D-12phage displayed peptide library)筛选到靶向人卵巢癌的12肽克隆,通过ELISA、细胞免疫荧光法等方法从细胞水平鉴定了最佳阳性多肽噬菌体克隆R20靶向卵巢癌细胞的特异性和敏感性。结果显示:R20可以特异的、敏感的与卵巢癌细胞SKOV3结合,不与正常细胞或者其他癌细胞结合,具备进一步研发为卵巢癌导向分子元件而应用于卵巢癌靶向诊治试剂或药物研发的潜力。

利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子特异结合肽及其抗肝癌作用的研究

目的利用噬菌体随机肽库筛选人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)特异结合肽并研究其抗肝癌作用。方法以hALR为靶分子,利用Ph.D.TM噬菌体肽展示系统筛选出与hALR特异性结合的单克隆噬菌体,ELISA法鉴定筛选出的单克隆噬菌体与hALR的结合性,对特异性结合噬菌体DNA中插入片段进行PCR扩增、测序及短肽合成,MTS法检测特异结合肽对人HepG2肝癌细胞增殖的影响,观察特异结合肽对裸鼠人HepG2肝癌移植瘤生长的影响。结果经过3轮生物淘筛,特异性结合噬菌体得到富集;筛选到的单克隆噬菌体与hALR结合具有特异性(与对照组比较P<0.05);特异结合肽在体外能抑制人HepG2肝癌细胞增殖(24 h抑制率为46.2%vs 6.5%,P<0.01;48 h抑制率为23.6%vs 5.9%,P<0.05),在体内能抑制裸鼠人HepG2肝癌移植瘤生长[(1.250±0.512)cm3vs(4.590±0.398)cm3,P<0.01;(1.100±0.453)g vs(3.794±0.299)g,P<0.01];该特异结合肽免疫小鼠后机体内无相应抗体检出,且对裸鼠的重要脏器组织结构及功能无明显损害。结论利用噬菌体肽库筛选到hALR特异结合肽,该短肽通过阻断hALR促肝癌细胞增殖作用,能抑制人HepG2肝癌细胞在体内外增殖,达到抗肝癌的作用,同时产生较低的免疫原性及毒性损害。

卵巢特异性启动子的研究进展

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率居第三位,病死率居首位,尽管通过手术和化疗后要达到临床和血液生化指标完全缓解,但是多数晚期患者仍会在2-3年内复发,最终结果是化疗耐药死亡。寻找新的卵巢癌治疗方法迫在眉睫。随着分子生物学技术的发展,靶向治疗的研究越来越多,因为肿瘤组织和正常组织之间的差异,通过分子生物技术手段,将药物或者自杀基因靶向导入到肿瘤组织内,而对正常组织无损害。基因的靶向治疗最重要的是将基因转入在体内并在特定的组织内表达,其中最为重要的部分是特异性启动子的作用。文章就启动子的特性,对卵巢特异性启动子的分类及研究进展作综述。

人卵巢癌细胞特异性结合短肽的原核表达及靶向性分析

目的通过原核表达的方式制备人卵巢癌HO8910细胞株特异性结合短肽(ovarian cancer specific binding peptide 1,OSBP-1)和氨基酸顺序重排的短肽(scrambled peptide,OSBP-S),探讨其对卵巢癌HO8910细胞的靶向特异性。方法构建pGEX-6P-3/OSBP-1与pGEX-6P-3/OSBP-S原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),进行GST融合蛋白的诱导表达和纯化,纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析无误后,进行融合蛋白的酶切及小分子肽Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,N端进行FITC标记。通过细胞免疫荧光和竞争性结合实验分析OSBP-1对人卵巢癌HO8910细胞株的靶向性,以及这种靶向性是否与特定的氨基酸顺序有关;通过亲和性试验研究OSBP-1与其他卵巢癌细胞、不同组织来源的肿瘤细胞及正常细胞的亲和性。结果成功构建了pGEX-6P-3/OSBP-1与pGEX-6P-3/OSBP-S原核表达载体;纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,出现单一的GST-OSBP-1和GST-OSBP-S蛋白条带;蛋白质印迹法分析证明,融合蛋白能被GST单克隆抗体识别;小分子肽Tricine-SDS-PAGE表明,成功获得OSBP-1和OSBP-S;标记后的FITC-OSBP-1与FITC-OSBP-S经高效液相色谱技术和质谱分析,纯度均>95%。细胞免疫荧光实验显示,FITC-OSBP-1对HO8910细胞有很强的结合能力,能进入细胞内显示很强的绿色荧光,但其与正常卵巢上皮细胞仅个别细胞显示绿光荧光,而FITC-OSBP-S与HO8910细胞和正常卵巢上皮细胞均显示很弱的绿色荧光。另外,随着FITC-OSBP-1浓度的增加,HO8910细胞的荧光强度增强;竞争性结合实验显示,FITC-OSBP-1与HO8910细胞的结合能力随着OSBP-1浓度的增加而下降,平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)递减,分别为0.140±0.002 1、0.062±0.001 5、0.027±0.002 0和0.009±0.001 5,差异有统计学意义(F=3 111,P<0.001),而加入不同浓度OSBP-S的MFI无明显变化,分别为0.142±0.004 2、0.142±0.005 7、0.139±0.002 5和0.138±0.001 5,差异无统计学意义,F=0.874,P=0.494;亲和性试验结果显示,FITC-OSBP-1与人卵巢癌HO8910细胞的MFI为0.157 4±0.001 1,明显大于FITC-OSBP-S阴性对照组0.006 2±0.000 5(t=219,P<0.001),与正常卵巢上皮细胞的MFI0.002±0.000 3,明显小于FITC-OSBP-S阴性对照组0.006 3±0.000 5(t=13.462,P<0.001),而与其他卵巢癌细胞OVCAR3、SKOV3、不同组织来源的肿瘤细胞LOVO、HepG2及正常细胞293T的MFI与FITC-OSBP-S阴性对照组分别比较,差异均无统计学意义,P>0.05。结论通过原核表达的方式成功制备OSBP-1和OSBP-S,证实OSBP-1对卵巢癌HO8910细胞具有浓度依赖性和氨基酸序列特异性靶向结合能力,且OSBP-1对正常卵巢上皮细胞几乎没有亲和力,对其他肿瘤细胞及正常细胞293T仅有很弱的亲和力,为卵巢癌的靶向治疗提供了理想的载体。

噬菌体特异性结合肽对乳腺癌干细胞生物学行为的影响

目的检测GY-1(GYSASRSTIPGK)与乳腺癌干细胞的亲和性及特异性,探讨其对乳腺癌干细胞体外生物学行为的影响,评估GY-1作为乳腺癌干细胞靶向治疗载体的临床价值。方法根据前期噬菌体肽库筛选实验获得的十二肽GY-1(GYSASRSTIPGK)序列,人工合成GY-1,同时合成随机氨基酸序列十二肽GY-2(GSAYITRSGPSK)作阴性对照,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及细胞免疫荧光法分别鉴定两者与乳腺癌干细胞231-SC(分离自MDA-MB-231细胞株)的亲和性及特异性;通过生长曲线及侵袭迁移实验检测十二肽GY-1对乳腺癌干细胞231-SC恶性生物学行为的影响。结果 ELISA结果显示,GY-1组231-SC吸光度为0.501±0.009,高于MDA-MB-231细胞(0.147±0.038)和hs578bst细胞(0.152±0.036),F=262.25,P<0.001;GY-2组中三组细胞的吸光度分别为0.148±0.003、0.146±0.005和0.149±0.001,F=0.63,P>0.05。细胞免疫荧光法显示GY-1对231-SC有高度亲和特异性,生长曲线结果显示,GY-1组231-SC细胞增殖能力显著低于GY-2组和PBS空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。侵袭实验中GY-1组231-SC细胞透过Transwell上室的细胞数为(22±2)个,低于GY-2对照组[(41±4)个]和空白对照组[(43±6)个],F=9.03,P=0.003。迁移实验中GY-1组231-SC细胞透过Transwell上室的细胞数为(66±7)个,低于GY-2对照组[(134±11)个]和空白对照组[(141±14)个],F=14.59,P<0.001。GY-2对照组和空白组差异比较均无统计学意义(P=0.78和P=0.66)。结论十二肽GY-1对靶细胞231-SC具有高度亲和特异性,并且能够抑制231-SC的生长、侵袭迁移,有可能成为乳腺癌干细胞靶向治疗的理想载体。