SOX7靶向ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠癌血管生成

目的探讨性别决定区Y框蛋白7(SOX7)对结直肠癌血管生成的影响及潜在作用机制。方法应用免疫荧光检测结直肠癌患者组织样本中SOX7表达水平,之后通过裸鼠、转染SOX7 mimic的人结直肠癌细胞系SW480细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养进一步研究。用Western-blot验证SOX7与ERK1/2/PD-L1对结直肠癌细胞的相关蛋白表达的影响。用CCK8检测SOX7与ERK1/2/PD-L1对HUVEC增殖的影响。通过体外内皮细胞成管实验测定SOX7与ERK1/2/PD-L1对肿瘤血管生成的影响。结果SOX7在人结直肠癌组织中表达被抑制(P<0.01),同时SOX7的过表达抑制了小鼠体内肿瘤生长(P<0.01)。SW480细胞中SOX7的过表达抑制了ERK1/2、c-Jun的表达,并在ERK1/2的激动剂Senkyunolide I的作用下上调了SW480细胞的ERK1/2、c-Jun蛋白表达(P<0.01),逆转了SOX7对SW480细胞中ERK1/2、c-Jun蛋白表达的影响(P<0.01)。HUVEC中SOX7抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,Senkyunolide I上调了HUVEC的PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,并逆转了SOX7对HUVEC中上述相关蛋白表达的影响(P<0.01)。PD-1/PD-L1 Inhibitor 3抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,SOX7过表达在PD-1/PD-L1 Inhibitor 3的影响下并没有表现出抑制作用。CCK8实验结果显示SOX7过表达显著抑制了HUVEC的增殖能力,Senkyunolide I作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显上升,PD-1/PD-L1 Inhibitor 3作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显下降,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。成管实验结果显示SOX7过表达抑制了HUVEC的血管生成,Senkyunolide I强烈加速了血管生成,而PD-1/PD-L1 Inhibitor 3血管生成则被显著抑制,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。结论SOX7通过ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠肿瘤的增殖和血管生成,SOX7可能是晚期CRC患者临床治疗中潜在的抗血管生成靶点。

牙龈卟啉单胞菌通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进食管鳞癌自噬

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)促进食管鳞癌(ESCC)细胞自噬发生的分子机制。方法Pg感染siAtg7或氯喹(CQ)预处理的KYSE70细胞和KYSE140细胞,Western blot检测Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白,荧光共聚焦显微镜检测mRFP-GFP-LC3标记ESCC细胞自噬流,CCK-8法检测ESCC细胞活性,迁移小室检测ESCC细胞迁移及侵袭能力。miR-21-5p inhibitor、RASA1过表达或U0126分别阻断miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路,如上检测自噬相关表型变化。免疫组化检测ESCC组织中Pg丰度和LC3蛋白表达,RT-PCR检测ESCC及其癌旁组织中miR-21-5p的表达,统计分析Pg、LC3和miR-21-5p相关性。结果Pg感染诱导KYSE70细胞和KYSE140细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达上调、p62蛋白表达下调,增加了mRFP-GFP-LC3标记细胞中的红色、绿色和黄色荧光斑点数目和荧光强度,同时促进KYSE70细胞和KYSE140细胞增殖、迁移和侵袭能力增加,上述Pg诱导的ESCC细胞表型改变被CQ或siAtg7预处理逆转。miR-21-5p inhibitor、U0126或RASA1过表达质粒的预处理,也同样逆转了Pg对ESCC细胞自噬的促进作用。Pg丰度与miR-21-5p、LC3蛋白表达呈正相关。结论Pg通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进ESCC自噬发生。

lncRNA TFAP2A-AS1/miR-9-5p通过ERK通路对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的:探讨长链非编码RNA TFAP2A-AS1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制。方法:选择50例子宫内膜癌组织和对应的癌旁组织。选取子宫内膜癌细胞株(RL95-2、HEC-1A、HHUA、HEC-1B及Ishikawa),子宫内膜上皮细胞hEEC。子宫内膜癌细胞株Ishikawa转染si-TFAP2A-AS1(si-TFAP2A-AS1组)、si-NC(si-NC组)、miR-9-5p mimics(miR-9-5p组)及miR-NC(miR-NC组);RL95-2细胞转染OE-TFAP2A-AS1(TFAP2A-AS1组)、Vector(Vector组)、sh-miR-9-5p(sh-miR-9-5p组)及sh-NC(sh-NC组)。CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭、迁移能力,双荧光素酶实验、pull down实验分析TFAP2A-AS1与miR-9-5p的靶向关系;miR-9-5p与ERK的靶向关系,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测子宫内膜癌组织、癌旁组织、子宫内膜癌细胞及hEEC细胞TFAP2AAS1、miR-9-5p表达水平,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)水平。结果:子宫内膜癌组织中TFAP2A-AS1表达水平低于癌旁组织,miR-9-5p表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。子宫内膜癌组织TFAP2A-AS1、miR-9-5p表达水平与分化程度、肿瘤直径、TNM分期及淋巴结转移有关。子宫内膜癌组织中TFAP2A-AS1、miR-9-5p表达水平呈负相关(r=-0.782,P=0.002)。与hEEC细胞比较,RL95-2、HEC-1A、HHUA、HEC-1B及Ishikawa细胞TFAP2A-AS1表达水平降低,miR-9-5p表达水平升高(P<0.05)。与si-NC组比较,si-TFAP2A-AS1组细胞48 h、72 h OD值,侵袭、迁移细胞数均升高(P<0.05);与Vector组比较,TFAP2A-AS1组细胞48 h、72 h OD值,侵袭、迁移细胞数均降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-9-5p组细胞48 h、72 h OD值,侵袭、迁移细胞数均升高(P<0.05);与sh-NC组比较,sh-miR-9-5p组细胞48 h、72 h OD值,侵袭、迁移细胞数均降低(P<0.05)。TFAP2A-AS1负性调控miR-9-5p、p-ERK表达水平,miR-9-5p可靶向调控ERK蛋白。结论:过表达TFAP2A-AS1通过靶向下调miR-9-5p,抑制ERK通路,最终抑制子宫内膜癌细胞恶性生物学行为。

miR-141-3p对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的抑制和改善作用

背景:研究表明,胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子有抑制纤维环细胞凋亡的作用。miR-141-3p微小RNA在骨髓基质细胞中随着年龄的增加而增加,且与炎症信号通路的活化存在一定关系,提示其可能成为腰椎间盘突出症的治疗靶点。目的:探究miR-141-3p通过调控胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的影响。方法:选取50只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组、miR-141-3p mimics组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用自体髓核移植法进行腰椎间盘突出症建模。建模成功后,对miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组和miR-141-3p mimics组大鼠鞘内分别注射10μL 20μmol/L miR-NC,miR-141-3p inhibitor,miR-141-3p mimics,均每天注射1次,连续注射28 d;正常组、模型组同期同位置注射同体积生理盐水。采用热缩足潜伏期阈值评价大鼠下肢疼痛,实时荧光定量PCR检测背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达,ELISA法检测背根神经节组织炎症因子,免疫印迹法检测背根神经节组织胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子蛋白表达,并分析miR-141-3p与胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子的相关性。结果与结论:miR-NC组各项指标与模型组比较,差异均无显著性意义。①大鼠热缩足潜伏期阈值:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。②背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。③背根神经节组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素1含量:模型组明显高于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显高于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显低于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。④背根神经节组织胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子蛋白表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。⑤胰岛素样生长因子1与miR-141-3p呈正相关(r=0.904,P<0.001),血小板源性生长因子与miR-141-3p呈正相关(r=0.879,P<0.001)。⑥结论:miR-141-3p可显著改善腰椎间盘突出症大鼠下肢疼痛,抑制背根神经节炎症,其机制可能与促进胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子表达有关。

LncRNA GATA3-AS1通过调控miR-362-3p/FABP5轴抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的:探究长链非编码RNA GATA3反义RNA 1(lncRNA GATA3-AS1)调控微小RNA-362-3p(miR-362-3p)表达对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:qRT-PCR检测宫颈癌细胞中lncRNA GATA3-AS1、miR-362-3p、FABP5表达;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA GATA3-AS1和miR-362-3p的靶向关系、miR-362-3p和FABP5的靶向关系;将细胞分为pcDNA-NC组、pcDNA-GATA3-AS1组、si-NC组、si-GATA3-AS1组、si-GATA3-AS1+inhibitor-NC组、si-GATA3-AS1+miR-362-3p inhibitor组、miR-NC组、miR-362-3p mimics组、miR-362-3p mimics+pcDNA-NC组、miR-362-3p mimics+pcDNA FABP5组;Western blot检测蛋白表达;EdU法检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移侵袭。结果:在宫颈癌细胞系中,GATA3-AS1、FABP5均为高表达,miR-362-3p均为低表达,选择HeLa细胞进行后续实验;双荧光素酶报告基因实验表明,lncRNA GATA3-AS1和miR-802、miR-362-3p和FABP5具有靶向关系;与pcDNA-NC组比较,pcDNA-GATA3-AS1组Hela细胞EdU阳性率、迁移侵袭及MMP-2、MMP-9表达明显上升(P<0.05);与si-NC组比较,si-GATA3-AS1组HeLa细胞EdU阳性率、迁移侵袭及MMP-2、MMP-9表达明显下降(P<0.05);抑制miR-362-3p表达或过表达FABP5均可以明显逆转沉默GATA3-AS1或过表达miR-362-3p对于HeLa细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论:沉默GATA3-AS1可以靶向上调miR-362-3p表达,抑制FABP5表达,抑制宫颈癌HeLa细胞增殖迁移及侵袭。

化瘀散水煎剂通过调控miR-129-5p/FOXC1轴抑制肝癌裸鼠移植瘤生长

目的:探讨化瘀散水煎剂通过调控微小RNA-129-5p/叉头框蛋白C1(FOXC1)轴对肝癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法:建立肝癌裸鼠移植瘤模型,并分为裸鼠NC组、化瘀散水煎剂组、化瘀散水煎剂+inhibitor-NC组、化瘀散水煎剂+miR-129-5p inhibitor组,每组8只。qRT-PCR法检测miR-129-5p、FOXC1 mRNA表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-129-5p与FOXC1靶向调控关系,观察记录裸鼠的瘤重及移植瘤体积,HE染色观察移植瘤组织形态,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡,免疫组织化学染色检测瘤组织Ki-67、Cleaved Caspase-3、FOXC1表达,Western blot检测Ki-67、Cleaved Caspase-3、FOXC1蛋白表达。结果:miR-129-5p在肝癌细胞中表达显著下降,FOXC1 mRNA表达显著升高,其中HepG2细胞变化最显著(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验表明miR-129-5p与FOXC1存在靶向调控关系;与NC组相比,化瘀散水煎剂组肿瘤细胞出现坏死,凋亡数增加,miR-129-5p、Cleaved Caspase-3显著升高,移植瘤质量和体积、FOXC1、Ki-67表达显著降低(P<0.05);下调miR-129-5p逆转化瘀散水煎剂对肝癌移植瘤的抑制作用(P<0.05)。结论:化瘀散水煎剂可能通过上调miR-129-5p从而下调FOXC1表达,进而抑制肝癌移植瘤生长。

基于miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭心肌纤维化的机制

目的基于miRNA21-5p调控转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)心肌纤维化的机制。方法40只4周龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)平均分为HFpEF组、沙库巴曲缬沙坦组(LCZ696,0.018 g·kg^(-1))、苓桂气化方低剂量组(LGQH-L,3.87 g·kg^(-1))和苓桂气化方高剂量组(LGQH-H,7.74 g·kg^(-1)),给予高脂、高盐及高糖饮食16周及腹腔注射链脲霉素溶液8周建立HFpEF大鼠模型。10只威斯塔京都(Wistar Kyoto,WKY)大鼠和10只SHR大鼠作为对照组,以普通饲料喂养至实验结束。造模成功后,WKY、SHR和HFpEF组给予等剂量生理盐水,其他3组按照预先规定的干预措施,每天灌胃1次,持续6周。干预结束后,行超声心动图测量左心室(left ventricle,LV)前壁厚度(LV end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、LV后壁厚度(LV end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、LV舒张末内径(LV end-diastolic internal diameter,LVIDd)、LV射血分数(LV ejection fraction,LVEF)、LV舒张早期二尖瓣流入峰值速度(E)、舒张晚期二尖瓣流入峰值速度(A)和LV舒张早期二尖瓣环运动速度(e'),并计算E/A和E/e';酶联免疫吸附试验检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠肽(B-type brain natriuretic peptide,BNP)及半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3);病理切片进行苏木精伊红及马松染色观察心肌肥厚及纤维化,并计算LV室壁厚度(LV wall thickness,LVWT)、胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及血管周围纤维化比率(perivascular fibrosis ratio,PFR);实时定量聚合酶链反应检测LV心肌miRNA21-5p及TGF-β1/Smads信号通路相关mRNA表达;蛋白印迹检测LV心肌TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,HFpEF组的LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR显著升高(P<0.05或P<0.01);LV心肌miR-NA21-5,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01);Smad7 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05或P<0.01)。与HFpEF组比较,苓桂气化方呈剂量依赖性减少LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR(P<0.05或P<0.01);下调miRNA21-5p,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、GF-β1、P-Smad2/3蛋白表达(P<0.05或P<0.01);上调Smad7 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论苓桂气化方可能通过靶向miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路抑制心肌纤维化,从而减轻HFpEF大鼠LV重塑和舒张功能障碍,是治疗HFpEF的有效中药复方。

lncRNA TUG1靶向调节miR-31-5p对急性胰腺炎小鼠炎症反应的影响

目的:探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)在急性胰腺炎(AP)中的作用机制。方法:体外培养小鼠胰腺腺泡细胞系(MPC-83),用脂多糖(LPS,10μg/ml)和雨蛙素(Caerulein,100 nmol/L)处理3 h,建立AP模型。实验分为对照组(control组)、AP组、AP+sh-NC组、AP+sh-TUG1组、AP+sh-TUG1+inhibitor-NC组、AP+sh-TUG1+miR-31-5p inhibitor组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA TUG1和miR-31-5p之间的靶向关系。构建AP小鼠模型,给予相应的干预后,qRT-PCR检测胰腺组织中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;试剂盒检测血清中炎症因子IL-1β、TNF-α含量和淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)活性;HE染色观察胰腺组织病理学变化;TUNEL检测胰腺组织中细胞凋亡。结果:在Caerulein和LPS共同处理的MPC-83细胞中lncRNA TUG1水平、细胞凋亡率、IL-1β和TNF-α水平升高,miR-31-5p水平、细胞活力降低(均P<0.05);敲低lncRNA TUG1可上调miR-31-5p,增加细胞活力,降低IL-1β和TNF-α水平,抑制细胞凋亡(均P<0.05);下调miR-31-5p表达可减弱敲低lncRNA TUG1对细胞炎症反应的抑制作用。miR-31-5p是lncRNA TUG1的直接靶标。在体内敲低lncRNA TUG1表达可上调AP小鼠胰腺组织中miR-31-5p表达,降低IL-1β、TNF-α水平,减少细胞凋亡,改善胰腺组织损伤。结论:敲低lncRNA TUG1可能通过上调miR-31-5p表达水平,抑制炎症反应,改善AP。

miR-132-3p/CAMTA1对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠施万细胞的调控作用

目的探讨miR-132-3p通过钙调素结合转录因子1(CAMTA1)对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠(FNI)中施万细胞的调控作用。方法用I-125粒子辐射大鼠施万细胞,并在细胞中转染miR-132-3p mimic、miR-132-3p inhibitor以及sh-CAMTA1。免疫荧光检测S100B和β-TubulinⅢ荧光强度。RT-qPCR检测miR-132-3p的表达,Western blot检测CAMTA1蛋白表达。EdU染色评估细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。同时,构建FNI大鼠模型并在大鼠面部植入I-125粒子,HE、LFB染色以及IF染色评估大鼠面神经组织的病理损伤。StarBase v2.0数据库和双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p和CAMTA1的靶向关系。结果S100B和β-TubulinⅢ在大鼠施万细胞中显著表达。I-125粒子辐射组中miR-132-3p表达降低(P<0.001),抑制细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.001)。过表达miR-132-3p或敲降CAMTA1显著促进施万细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.05),敲降miR-132-3p则具有相反的作用。机制研究显示,miR-132-3p靶向负调控CAMTA1。体内实验结果显示,过表达miR-132-3p通过抑制CAMTA1的蛋白表达,减弱I-125粒子对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。结论过表达miR-132-3p抑制CAMTA1的表达,促进施万细胞的增殖和迁移,抑制I-125对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。

circLRP6调节miR-31-5p/HMGA1轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的分析circLRP6调节miR-31-5p/高迁移率族蛋白A1(HMGA1)轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,分为对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-circLRP6组、高糖+si-circLRP6+miR-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组,对照组置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,其余各组置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,并通过Lipofectamine 2000将相应质粒转染至HK-2细胞内,实时定量PCR测定细胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1 mRNA水平,试剂盒测定细胞上清液白细胞介素-6(IL-6)水平、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及丙二醛(MDA)含量;流式细胞仪观察细胞凋亡;Western blotting测定细胞HMGA1、Bax、Bcl-2蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验分析miR-31-5p与circLRP6、HMGA1的靶向关系。结果与对照组相比,高糖组HK-2细胞circLRP6水平升高,细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+si-circLRP6组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05)。miR-31-5p与circLRP6、HMGA1均具有靶向关系。结论沉默circLRP6可能通过上调miR-31-5p,抑制HMGA1表达,对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。

MicroRNA-137-5p靶向USP30改善阿尔茨海默病

目的 探索miR-137-5p对阿尔茨海默病(AD)的保护机制。方法 首先用qRT-PCR评估AD患者和健康对照组人血清中miR-137和USP30的表达。用D-半乳糖和氯化铝建立AD小鼠模型,用水迷宫试验检测小鼠的行为,确认AD小鼠模型的成功。用Aβ1-42寡聚体诱导的SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型,通过实时定量聚合酶链反应检测AD模型中miR-137-5p和USP30的表达。双重荧光素酶试验用于验证miR-137-5p和USP30之间的靶向结合关系。结果 miR-137-5p的表达在AD患者中与健康对照组相比有所下降(P<0.05),而USP30则明显增加(P<0.05)。miR-137-5p能改善AD细胞模型中的细胞凋亡,USP30的过表达部分废除了miR-137-5p对Aβ1-42-处理的SH-SY5Y细胞的影响,miR-137-5p通过靶向USP30改善AD小鼠的认知能力和Aβ的沉积。结论 miR-137-5p可以通过下调USP30来改善AD症状,miR-137-5p可能能成为治疗AD的一个靶点。

水飞蓟素通过调控miR-124-3p/WEE1轴影响胶质瘤细胞恶性生长的机制研究

目的探讨水飞蓟素(SM)对胶质瘤细胞恶性生长的影响以及对miR-124-3p/WEE1轴的调控机制。方法将胶质瘤U87细胞分为对照组,SM低、中、高浓度组,SM高浓度+miR-124-3p抑制剂组(SM高+miR-124-3p inhibitor组)。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting检测细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及凋亡相关蛋白的表达,实时定量PCR检测细胞中miR-124-3p和WEE1 mRNA水平,荧光素酶活性实验验证miR-124-3p和WEE1之间的靶向关系,建立NOD/SCID小鼠颅内移植瘤模型并进行给药和分析。结果与对照组比较,不同浓度SM处理组的细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、cyclin D1蛋白表达、WEE1 mRNA表达水平降低,G0/G1周期细胞数、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及miR-124-3p表达升高(P<0.05);进一步转染miR-124-3p inhibitor后发现,SM对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用被逆转。小鼠体内实验显示,SM处理组肿瘤的质量和体积均低于模型组(P<0.05),且小鼠体质量无显著变化(P>0.05)。结论SM可通过上调miR-124-3p靶向下调WEE1抑制胶质瘤细胞的恶性生长。

circFAT1调节miR-211-5p/CCND2轴对糖尿病心肌病大鼠心肌损伤的影响

目的探讨circFAT1对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌损伤的影响及对miR-211-5p/细胞周期蛋白D2(CCND2)轴的调节机制。方法利用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素建立DCM大鼠模型,并随机分为DCM组、circ-NC组、circFAT1组、circFAT1+激动剂-NC组和circFAT1+miR-211-5p激动剂组,以喂食普通饲料的大鼠作为对照组,每组20只。实时PCR检测心肌组织中circFAT1、miR-211-5p、CCND2水平;Western blotting检测心肌组织CCND2蛋白表达;生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平;心脏超声检测大鼠心功能;HE和Masson染色观察心肌组织病理形态;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况;ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证circFAT1、miR-211-5p、CCND2之间的靶向关系。结果与对照组相比,DCM组circFAT1、CCND2 mRNA及蛋白表达,左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)水平降低(P<0.05),FBG、TC、TG、左心室舒张末期直径(LVEDd)、左心室收缩末期直径(LVEDs)、胶原容积分数(CVF)、细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05);与DCM组相比,circFAT1组circFAT1、CCND2 mRNA及蛋白表达,LVEF、LVFS水平升高(P<0.05),FBG、TC、TG、LVEDd、LVEDs、CVF、细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05);miR-211-5p激动剂逆转了circFAT1对DCM心肌损伤的缓解作用,且CCND2 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论circFAT1通过调控miR-211-5p/CCND2轴减轻DCM大鼠心肌组织损伤。

mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响

旨在研究马立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)编码的mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响,将mdv1-miR-M4-5p模拟物、抑制物及其阴性对照转染MDCC-MSB1细胞后48 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相关分子的转录;CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果显示:与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p模拟物转染显著上调MDCC-MSB1细胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的转录水平,下调TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表达转录,促进细胞的增殖,减少G1期细胞,增加S和G2细胞,降低细胞凋亡率。与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p抑制物转染后MDCC-MSB1细胞的增殖、凋亡及其相关分子转录的结果与mdv1-miR-M4-5p模拟物转染后的结果相反。综上,Mdv1-miR-M4-5p可促进MDCC-MSB1细胞增殖,抑制其凋亡,这可能是通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路来实现的。

miR-495-3p靶向BUB1调控STAT3信号通路对食管癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨miR-495-3p靶向苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1(BUB1)调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对食管癌细胞生物学行为的影响。方法 使用cDNA芯片技术筛选出食管癌组织和正常组织差异表达基因,并用生物信息学方法进行分析。运用TargetScan数据库对miRNA的靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告基因检测技术进行验证。将KYSE150细胞分为空白对照组、NC mimics组和miR-495-3p mimics组。通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖活力。用流式细胞术测定细胞周期和凋亡。通过定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定BUB1 mRNA的表达水平。通过蛋白质印迹法(Western blot)测量BUB1、STAT3、磷酸化(p)-STAT3、细胞周期蛋白B1(CCNB1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和半胱氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)蛋白水平。用划痕和Transwell小室实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 差异表达基因参与生物学过程、信号通路和网络构建主要与细胞周期相关,BUB1是关键的核心(Hub)基因,miR-495-3p靶向调控BUB1。体外实验表明,过表达miR-495-3p能显着抑制食管癌细胞的生长、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞。过表达miR-495-3p处理后,食管癌细胞中Caspase-3、Caspase-9表达量升高(P<0.01),而Bcl-2、BUB1、CCNB1、CDK1、p-STAT3表达量降低(P<0.01)。STAT3信号通路也被发现在此过程中发挥着重要作用。结论 miR-495-3p可能通过下调BUB1介导STAT3信号通路影响食管癌细胞的生物学行为。

安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

目的 探讨安罗替尼对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 将非小细胞肺癌细胞系A549和H1299分别采用安罗替尼、miR-16-5p激动剂和/或PD-1过表达载体进行处理。CCK-8实验和EDU实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-16-5p相对表达量;Western blot检测程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)的表达。双荧光素酶报告实验确定miR-16-5p和PD-1的靶向关系。用A549细胞构建裸鼠成瘤模型,检测安罗替尼对体内肿瘤生长的影响。结果 安罗替尼在A549和H1299细胞中以剂量依赖的方式显著增加miR-16-5p表达,同时降低PD-1表达,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p过表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p能靶向PD-1,且负调控PD-1表达。siRNA下调PD-1表达后明显抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达PD-1则可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549和H1299细胞的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。体内实验证实,安罗替尼能够明显抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论 安罗替尼可有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,减少体内肿瘤生长,其作用机制与miR-16-5p/PD-1信号轴相关。

miR-141-3p靶向调控HMGB1对LPS诱导的A549细胞损伤的影响

目的探讨miR-141-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白1(HMGB1)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞损伤的影响。方法以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,将miR-141-3p mimics、mimics NC、HMGB1基因过表达质粒(pcDNA3.1-HMGB1)和空载质粒(Vector)分别或共转染至A549细胞中,再采用10μg/ml LPS处理24 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞增殖活性;比色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与HMGB1之间的靶向调控关系。结果LPS干预后,A549细胞增殖活性及细胞中miR-141-3p表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及上清液中LDH活性升高(P<0.05)。过表达miR-141-3p可增强LPS处理后的A549细胞增殖活性(P<0.05),降低细胞凋亡率及细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和上清液中LDH活性(P<0.05)。然而,HMGB1基因过表达可逆转miR-141-3p对LPS诱导A549细胞损伤的改善作用。双荧光素酶报告基因实验证实,HMGB1是miR-141-3p下游靶基因。结论miR-141-3p可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,降低炎症因子表达水平,改善A549细胞损伤,其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。

miR-1-3p通过调控STC2抑制人食管鳞状细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的探讨miR-1-3p对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的恶性生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法利用基因表达数据库(GEO)筛选ESCC中差异表达的miRNA。采用qRT-PCR检测人ESCC细胞KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510和Eca109及正常食管上皮细胞HET-1A中miR-1-3p的表达水平。CCK-8试剂盒、划痕愈合和Transwell实验以及流式细胞术分别检测转染miR-1-3p mimic对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡能力的影响。使用生物信息学工具预测miR-1-3p的靶基因,Kaplan-Meier法分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中STC2表达水平与患者预后的关系。采用FISH检测miR-1-3p的亚细胞定位,双荧光素酶报告基因验证miR-1-3p与STC2的靶向关系。RNA免疫沉淀(RIP)实验检测miR-1-3phe STC2的结合。Western blot法检测转染miR-1-3p mimic对ESCC细胞中STC2及内质网应激相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF4表达水平的影响。CCK-8、划痕愈合、Transwell实验和流式细胞术分别检测过表达和敲低STC2对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响。结果ESCC细胞中miR-1-3p的表达水平均低于HET-1A细胞(均P<0.05),转染miR-1-3p mimic可抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),促进ESCC细胞凋亡(均P<0.001)。生物信息学工具预测miR-1-3p的靶基因为STC2,ESCC组织中STC2的表达水平高于正常食管上皮组织,与预后呈负相关(均P<0.05)。miR-1-3p位于胞质,并可直接与STC2 mRNA结合。转染miR-1-3p mimic可下调STC2、p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白的表达水平(均P<0.05)。过表达STC2可促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),抑制ESCC细胞凋亡(均P<0.05)。敲低STC2可抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),促进ESCC细胞凋亡(均P<0.05)。结论miR-1-3p通过靶向调控STC2抑制ESCC细胞的恶性生物学行为,促进ESCC细胞凋亡,可能是通过抑制内质网应激发挥作用。

紫檀芪调控微小RNA-340-5p/髓细胞白血病-1轴对胆囊癌SD细胞生物学行为的影响实验研究

目的:探究紫檀芪(PTS)调控微小RNA-340-5p(miR-340-5p)/髓细胞白血病-1(MCL-1)轴对胆囊癌SD(GBC-SD)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:体外培养人GBC-SD细胞,使用不同浓度PTS(0、5、10、20、40、80μmol/L)处理GBC-SD细胞,然后检测细胞存活率。将GBC-SD细胞分为对照组(DMEM培养基常规培养GBC-SD细胞)、PTS组(加入80μmol/L的PTS培养GBC-SD细胞)、PTS+空载质粒组(加入80μmol/L的PTS培养GBC-SD细胞,并转染空载质粒)、PTS+miR-340-5p沉默组[加入80μmol/L的PTS培养GBC-SD细胞,并转染miR-340-5p小干扰RNA(siRNA)质粒]。分别检测各组GBC-SD细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-340-5p和MCL-1 mRNA表达。蛋白印迹法检测MCL-1及增殖凋亡相关蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-340-5p与MCL-1的靶向关系。裸鼠移植瘤实验检测PTS对裸鼠肿瘤生长及miR-340-5p/MCL-1轴的影响。结果:随着PTS浓度的升高,GBC-SD细胞存活率逐渐降低(均P<0.05)。与对照组比较,PTS组细胞存活率、集落形成数、细胞迁移率、细胞侵袭数、MCL-1 mRNA和蛋白、Ki67、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达降低,细胞凋亡率、miR-340-5p、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高(均P<0.05)。沉默miR-340-5p可逆转PTS对GBC-SD细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及miR-340-5p/MCL-1轴的作用效果(均P<0.05)。miR-340-5p与MCL-1存在靶向调控关系。PTS能抑制裸鼠肿瘤生长和MCL-1 mRNA和蛋白表达,促进miR-340-5p表达(均P<0.05)。结论:PTS可通过上调miR-340-5p表达下调MCL-1表达,抑制GBC-SD细胞增殖、迁移和侵袭,促进GBC-SD细胞凋亡。

miR-139-5p靶向Notch1抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探究miR-139-5p在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)进展中的作用和调控机制。方法实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测LUAD组织和细胞中miR-139-5p和Notch同源物1(Notch1)的表达。经细胞转染后,qRT-PCR和蛋白质印迹验证转染效率。CCK-8、细胞划痕和Transwell实验用于检测LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因分析miR-139-5p与Notch1的靶向关系。蛋白质印迹检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果与正常组织和人正常支气管上皮细胞相比,miR-139-5p在LUAD组织和细胞中显著下调(P<0.01),Notch1显著上调(P<0.01)。与对照组相比,过表达miR-139-5p明显抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭,并下调p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达(P<0.01)。Notch1被确定为miR-139-5p的直接靶标。过表达Notch1减弱了miR-139-5p过表达对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P<0.05)。与对照组比较,miR-139-5p在体内显著抑制了异形移植瘤的生长(P<0.05)。结论miR-139-5p通过靶向Notch1并失活PI3K/Akt/mTOR途径抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。