克隆表达的犬吉氏巴贝斯虫重组GST-P130kDa用于血清学诊断

利用抗体法(picoBlueTMImmunscreeningKit,应用B.gibsoni感染血清)从犬吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)裂殖子mRNA制备的吉氏巴贝斯虫cDNA文库中进行免疫筛选,选出目的基因相cDNA片段(阳性克隆)。测序验证后将该cDNA(基因)克隆至原核表达载体pGEX4T3,构建重组质粒,在大肠杆菌E.coli(DH5a)中以GST融合蛋白的形式表达(SDSPAGE分析证明);表达产物为130kDa的可溶性融合蛋白。免疫学分析(Westernblot和ELISA)结果表明,犬吉氏巴贝斯虫重组GSTP130kDa融合蛋白(rBgGSTP130kDa)能与犬吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)感染血清起反应,且与犬巴贝斯虫(B.canis)无交叉反应。本试验利用犬吉氏巴贝斯虫重组BgGSTP130kDa融合蛋白(作为重组抗原)检测巴西(n=310)、日本(n=100)和中国(n=114,n=30)等国随机采集的自然感染狗血清,其结果为巴西狗血清阳性率为55%、日本为8%、中国为1～9%;其结果与间接荧光抗体法(IFAT)结果为一致(作为验证)。结果表明重组BgGSTP130kDa融合蛋白具有较强的免疫原性和特异性,可用于吉氏巴贝斯虫病的诊断,这为吉氏巴贝斯虫病的早期诊断和深入研究犬吉氏巴贝斯虫病的特异性重组抗原及重组疫苗奠定基础。

应用加端PCR克隆弓形虫P30基因

为了采用基因工程方法大量生产高效抗原提供技术，根据已发表的弓形虫RH株P30的核苷酸序列，设计了一对加端引物，运用PCR方法，从弓形虫NT株中扩增出约800bp的片段。产物经EcoRI和XbaI酶切后，克隆进PUC19载体，经酶切和PCR鉴定，插入片段为P30基因。