基于P&T-GC/MS指纹图谱技术的烟用香精质量控制评价方法

利用P&T-GC/MS指纹图谱技术,结合夹角余弦相似度、峰匹配及多元T^(2)控制图,对烟用香精的质量稳定性进行综合评价,结果表明:P&T最优的前处理条件为吹扫时间14 min,吹扫温度40℃,解析温度200℃,在该条件下测得烟用香精中各挥发性成分特征色谱峰的RSD为1.36%~6.98%,说明该方法精密度良好;指纹图谱结合夹角余弦相似度、峰匹配分析及多元T^(2)控制图,可快速识别组分发生变化的烟用香精样品,及时发现样品的错混、质量浓度改变等问题,有效监控烟用香精的质量稳定性,并有助于进一步分析化学组分发生变化的根本原因。

口腔扁平苔藓患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平与病损程度及Th17/Treg失衡的关系

目的探讨口腔扁平苔藓(OLP)患者血清微小核糖核酸-155-5p(miR-155-5p)、细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)mRNA水平与病损程度及辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)失衡的关系。方法选择OLP患者76例(观察组),其中非糜烂型28例、糜烂型48例(轻中度糜烂29例、重度糜烂19例),同期随机另选体检健康的志愿者50例(对照组),采集所有研究对象外周静脉血,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA,采用流式细胞术检测Th17、Treg比例并计算Th17/Treg。采用Pearson/Spearman相关分析法分析OLP患者血清miR-155-5p水平与SOCS1 mRNA水平的关系以及二者与外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg的关系。结果与对照组比较,观察组血清miR-155-5p水平以及外周血Th17比例和Th17/Treg升高,血清SOCS1 mRNA水平和外周血Treg比例降低(P均<0.05)。非糜烂型OLP及糜烂型OLP轻中度糜烂、重度糜烂患者血清miR-155-5p水平以及外周血Th17比例和Th17/Treg逐渐升高,血清SOCS1 mRNA水平和外周血Treg比例逐渐降低(P均<0.05)。相关性分析显示,OLP患者血清miR-155-5p水平与血清SOCS1 mRNA水平呈负相关关系(r=-0.809,P<0.01);血清miR-155-5p水平与外周血Th17比例、Th17/Treg均呈正相关关系(r/rs分别为0.819、0.820,P均<0.05),与Treg比例呈负相关关系(r=-0.735,P<0.05);血清SOCS1 mRNA水平与外周血Th17比例、Th17/Treg均呈负相关关系(r/rs分别为-0.770、-0.790,P均<0.05),与Treg比例呈正相关关系(r=0.733,P<0.05)。结论OLP患者血清miR-155-5p水平升高、血清SOCS1 mRNA水平降低,二者水平变化与病损程度加重和Th17/Treg失衡密切相关。

冠心病患者动态心电图检查中P波离散度、T波峰-末间期的变化及诊断价值研究

目的:探讨冠心病(CHD)患者动态心电图检查中P波离散度(Pd)、T波峰-末(Tp-Te)间期的变化及诊断价值。方法:选取CHD患者203例作为研究组,其中,心肌缺血95例作为心肌缺血组,心肌缺血合并心律失常108例作为心肌缺血合并心律失常组。另取同期体检健康者90例作为对照组。所有受试者均接受动态心电图检查,并记录Pd、Tp-Te间期情况。比较研究组和对照组以及心肌缺血组和心肌缺血合并心律失常组Pd、Tp-Te间期。绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析Pd、Tp-Te间期对CHD及CHD心律失常的诊断价值。结果:研究组Pd、Tp-Te间期大于对照组(均P<0.05)。Pd、Tp-Te间期联合诊断CHD的AUC高于两者单独诊断的AUC(均P<0.05)。心肌缺血合并心律失常组Pd、Tp-Te间期大于心肌缺血组(均P<0.05)。Pd、Tp-Te间期联合诊断CHD患者心律失常的AUC高于两者单独诊断的AUC(均P<0.05)。结论:CHD患者动态心电图Pd增加及Tp-Te间期延长,且心肌缺血合并心律失常患者Pd增加及Tp-Te间期延长较心肌缺血患者更为明显,两者联合对CHD及CHD心律失常诊断价值较高。

变应性鼻炎患者血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达与Treg/Th17平衡的关系

目的探讨变应性鼻炎(AR)患者血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达与调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞(Th)17平衡的关系。方法选择98例AR患者(AR组)和30例健康体检志愿者(对照组),根据疾病严重程度将AR患者分为轻度组(51例)、中重度组(47例)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达,采用流式法检测外周血中Treg、Th17及其细胞因子。Pearson相关性分析血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达与外周血中Treg、Th17及其细胞因子以及miR-149-5p与Notch1 mRNA表达的相关性。结果AR组血清miR-149-5p表达,白细胞介素(IL)-10、转化生长因子-β(1 TGF-β1)水平以及外周血Treg细胞、Treg/Th17值低于对照组(P均<0.05),血清Notch1 mRNA表达,IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞高于对照组(P均<0.05)。中重度组血清miR-149-5p表达,IL-10、TGF-β1水平以及外周血Treg细胞、Treg/Th17值低于轻度组(P均<0.05),血清Notch1 mRNA表达,IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞高于轻度组(P均<0.05)。AR组血清miR-149-5p表达与外周血Treg细胞、Treg/Th17值、血清IL-10、TGF-β1水平呈正相关(r分别为0.367、0.539、0.265、0.301,P均<0.05),与血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞呈负相关(r分别为-0.289、-0.213、-0.336、-0.243、-0.221,P均<0.05)。Notch1 mRNA表达与外周血Treg细胞、Treg/Th17值、血清IL-10、TGF-β1水平呈负相关(r分别为-0.346、-0.508、-0.281、-0.293,P均<0.05),与血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞呈正相关(r分别为0.326、0.241、0.302、0.285、0.237,P均<0.05)。血清miR-149-5p与Notch1 mRNA表达呈负相关(r=-0.550,P<0.05)。结论AR患者血清miR-149-5p表达下调,Notch1 mRNA表达上调,且与AR患者Treg/Th17失衡有关。

EBV miR-BART17-3p对原发免疫性血小板减少症患儿Treg/Th17平衡的影响

目的探讨EBV mi R-BART17-3p影响原发免疫性血小板减少症(ITP)患儿Treg/Th17平衡的机制。方法收集ITP患儿(ITP组,20例)和健康儿童(对照组,20例)外周血并分离CD_(4)^(+)T细胞。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法、Western blot法、酶联免疫吸附法检测EBV mi R-BART17-3p、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)、叉头框蛋白P3(Fox P3)、白细胞介素17A(IL-17A)和转化生长因子-β(TGF-β)的m RNA、蛋白表达水平及含量。采用双荧光素酶报告基因实验考察EBV mi R-BART17-3p对Tim-3表达水平的影响。将15只BALB/C小鼠随机分为空白对照组、模型组、观察组,各5只。腹腔注射抗血小板抗体MWReg30以复制ITP小鼠模型,建模4 d后观察组小鼠予尾静脉注射携带EBV mi R-BART17-3p inhibitor的腺病毒载体。细胞染色并观察形态,检测外周血中TGF-β、IL-17A含量及血小板计数,采用流式细胞仪分别检测CD_(4)^(+)T细胞中Th17和Treg水平,并计算二者百分比。结果与对照组比较,ITP组患儿外周血EBV mi R-BART17-3p表达水平显著升高,Tim-3和TGF-βm RNA表达水平显著降低(P<0.05);Tim-3 m RNA表达水平与EBV mi R-BART17-3p表达水平呈显著负相关(r=-0.732,P<0.001)。Tim-3慢病毒载体p LKO.1-sh-Tim-3(sh-Tim-3)可显著降低Tim-3、Fox P3、TGF-β水平(P<0.05)。mi R-BART17-3p mimic显著升高了CD_(4)^(+)T细胞中mi R-BART17-3p的表达水平,并显著降低了Tim-3、Fox P3、TGF-βm RNA和蛋白表达水平(P<0.05);mi R-BART17-3p mimic可显著降低TGF-β含量,Tim-3+mi R-BART17-3p过表达逆转了mi R-BART17-3p mimic对TGF-β的抑制作用。动物实验结果显示,沉默EBV mi R-BART17-3p可促进Treg分化,减少脾脏和骨髓组织中的巨核细胞计数,并显著增加外周血中血小板计数。结论EBV mi R-BART17-3p可通过Fox P3/Tim-3途径调节ITP患儿Treg/Th17的免疫失衡。

PT-GC-CVAFS法测定沉积物中甲基汞的影响因素及应用

研究了碱提取吹扫捕集气相色谱冷原子荧光光谱法测定沉积物中甲基汞的影响因素,包括载气流速、柱温、衍生化试剂、样品称取量、前处理时碱性提取液加入量和反应瓶中提取液加入量的影响,分析了提取液加入量对Tenax管的影响、提取液保存的影响因素、沉积物样品保存的影响因素以及样品中Hg^(2+)的干扰影响。根据影响情况确定最佳测定条件,应用于广西龙江河流域上9个代表性监测断面的底泥样品中甲基汞的测定,采用污染指数法对该流域甲基汞的污染现状进行评价。结果表明,最佳载气流速范围为22~27 mL/min,最佳柱温为46℃。衍生化试剂选择四乙基硼化钠和四丙基硼化钠均能达到较好的回收率。样品称取量选择0.50 g时回收率好。前处理时碱性提取液的加入量对甲基汞的提取效率没有显著影响。为保证水相衍生反应体系最终pH在5左右,乙酸-乙酸钠缓冲溶液的加入量随提取液加入量的增加而增加。当缓冲溶液为300μL时,提取液小于150μL不会影响Tenax管性能。避光与否对提取液的保存和样品的保存影响都不大,提取液保存3 d后、样品保存15 d后,甲基汞回收率将低于80%。衍生化前定量体积提取液中Hg^(2+)含量与甲基汞浓度呈现正相关性。广西龙江河流域上9个断面的甲基汞污染等级及平均值浓度污染等级都显示为中度污染。

SDE-GC-MS与P&T-TD-GC-MS提取分析不同香型凤凰单丛茶香气比较

分别采用同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction,SDE)法和吹扫捕集热脱附解吸(purge and trap thermal desorption,P&T-TD)法提取黄栀香和肉桂香两种香型凤凰单丛茶的香气成分并用气相色谱-质谱进行分析比较。结果表明,2种方法提取的香气成分和相对含量比例有很大差异,两者各有优劣,相互补充,结合分析更加完整,更有利于准确地进行香型分类,并发现P&T-TD法有更大的运用空间。SDE法提取的萜烯类化合物较多,脂肪族和芳香族的化合物较少,不同香型的区别主要是成分的相对含量比例;P&T-TD法提取得到的成分种类多,不同香型的茶区别较大。通过萜酯指数可得P&T-TD法提取的香气更为清香,SDE法提取的香气较为浓烈,但两者都体现了凤凰茶清高持久的幽香特性。SDE法的高温加热可能引起成分的改变,P&T-TD提取法的成分较能真实地反应茶汤冲泡的特点。结合2种方法分析得出,黄栀香与肉桂香茶的区别明显,黄栀香茶以荜澄茄醇、橙花叔醇等为主,并特有丙酸芳樟酯、δ-杜松烯、萜品油烯等成分;肉桂香茶是吲哚、δ-壬内酯、苯乙腈相对含量多,且含有苯乙醇、苯甲醇、1,5,8-对-薄荷三烯、戊醛等特有成分。

P&T-GC-CVAFS法测定海产动物中的甲基汞和乙基汞

海产动物样品经过30%硝酸溶液提取,用2 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液调节pH后,用吹扫捕集-气相色谱-冷原子荧光光谱仪联用系统测定其中的甲基汞和乙基汞的含量。使用衍生试剂,将甲基汞转化为甲基丙基汞,乙基汞转化为乙基丙基汞,吹扫捕集进行富集并进一步消除基体干扰。以空白样品为基体,添加3种浓度水平的甲基汞和乙基汞标准溶液,测得甲基汞的回收率为80.5%～103.2%,相对标准偏差（n=6）为1.7%～6.9%;乙基汞的回收率在84.2%～103.7%,相对标准偏差（n=6）为2.3%～7.0%。

miR-210-3p通过自噬调控MC3T3-E1细胞成骨分化的机制研究

目的:探讨微小RNA-210-3p(microRNA-210-3p,miR-210-3p)通过自噬对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化的影响。方法:(1)采用脂质体转染法构建miR-210-3p过表达或沉默的MC3T3-E1细胞模型,设置阴性对照(negative control,NC)mimic组、miR-210-3p mimic组、NC inhibitor组和miR-210-3p inhibitor组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标及自噬相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(2)用雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)分别构建自噬激活和抑制模型,设置control组、RAPA组和3-MA组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测自噬激活或抑制后MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(3)设置NC mimic组、NC mimic+RAPA组和miR-210-3p mimic+RAPA组,Western blot和RT-qPCR检测各组MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标的变化。结果:(1)与NC mimic组相比,miR-210-3p mimic组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞内Runx2免疫荧光强度升高,矿化结节数目增加,细胞自噬水平显著降低(P<0.05)。与NC inhibitor组相比,miR-210-3p inhibitor组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞内Runx2疫荧光强度降低,矿化结节数目减少,细胞自噬水平显著升高(P<0.05)。(2)与control组相比,3-MA组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞内Runx2免疫荧光强度升高,而RAPA组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞内Runx2免疫荧光强度降低。(3)miR-210-3p过表达可逆转RAPA对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制作用(P<0.01)。结论:miR-210-3p可通过降低自噬水平促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。

动态心电图P波离散度和Tp-e间期联合血压变异性对原发性高血压患者室性心律失常易感性的预测效能

目的 观察原发性高血压患者室性心律失常易感性状况,并分析动态心电图P波离散度、T波峰-末(Tp-e)间期联合血压变异性对其预测效能。方法 纳入2020年6月至2022年6月医院126例原发性高血压患者为研究对象。入院时所有患者均接受动态心电图检查与血压变异性检查,记录P波离散度、Tp-e间期值,观察患者室性心律失常发生状况,并将其分为室性心律失常组与非室性心律失常组,分析动态心电图P波离散度、Tp-e间期联合血压变异性对原发性高血压患者室性心律失常易感性的预测效能。结果 126例原发性高血压患者中发生室性心律失常39例,占30.95%;室性心律失常组右心房横径(RAD)[(47.39±6.25)mm]长于非室性心律失常组[(40.37±6.74)mm],P波离散度[(42.82±8.14)ms]、Tp-e间期[(112.96±11.34)ms]、24 h舒张压标准差(24 h diastolic blood pressure standard deviation,24 h DPB-SD)[(13.79±5.22)mmHg]、24 h收缩压标准差(24 h systolic blood pressure standard deviation,24 h SBP-SD)值[(18.75±5.76)ms]高于非室性心律失常组[(36.16±7.28)ms、(99.23±12.61)ms、(9.78±4.36)mmHg、(14.03±5.17)mmHg](P<0.05);经点二列相关性分析显示,动态心电图P波离散度、Tp-e间期、血压变异性(24 h DPB-SD、24 h SBP-SD)值与原发性高血压患者发生室性心律失常呈正相关(r=0.276、0.463、0.207、0.293,P均<0.05);经logistic回归分析,结果显示,高P波离散度、高Tp-e间期、高24 h DPB-SD、高24 h SBP-SD是原发性高血压患者发生室性心律失常的危险因素(OR=1.112、1.095、1.199、1.177,P<0.05);ROC曲线结果显示,P波离散度、Tp-e间期、24 h DPB-SD、24 h SBP-SD预测原发性高血压患者发生室性心律失常的AUC分别为0.733(95%CI 0.635~0.830)、0.800(95%CI 0.723~0.877)、0.719(95%CI 0.621~0.817)、0.712(95%CI 0.614~0.810)、0.912(95%CI 0.863~0.961)。结论 动态心电图P波离散度、Tp-e间期联合血压变异性对原发性高血压患者室性心律失常易感性具有较高预测价值。

过敏性鼻炎患儿血清miR-124-3p和GATA3表达水平与疾病严重程度、Th1/Th2平衡的关系

目的探讨过敏性鼻炎(AR)患儿血清微RNA-124-3p(miR-124-3p)、GATA结合蛋白3(GATA3)表达与患儿疾病严重程度、Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)/Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)平衡的相关性。方法选择2020年6月至2022年4月在江苏省无锡市妇幼保健院(以下简称“我院”)儿童保健耳鼻喉科确诊的AR患儿87例为观察对象(AR组),按症状严重程度分为轻度组53例、中重度组34例,另选取同期在我院健康体检儿童85例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清miR-124-3p表达水平,流式细胞术检测Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2,采用酶联免疫吸附法检测血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素12(IL-12)、IL-4、IL-5、IL-10、GATA3水平,Pearson法分析AR患儿血清miR-124-3p表达与GATA3相关性,mi R-124-3p、GATA3与Th1/Th2及细胞因子相关性。结果AR组血清mi R-124-3p表达水平低于对照组,GATA3水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中重度组血清mi R-124-3p表达水平低于轻度组,GATA3水平高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。AR组Th1细胞比例和Th1/Th2比值低于对照组,Th2细胞比例高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。AR组血清IFN-γ、IL-12水平低于对照组,IL-4、IL-5、IL-10水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,AR患儿血清miR-124-3p表达水平与GATA3水平呈负相关(r<0,P<0.05)。miR-124-3p与Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12呈正相关(r>0,P<0.05),与Th2、IL-4、IL-5、IL-10呈负相关(r<0,P<0.05);GATA3与Th1、Th1/Th2、IFN-γ、IL-12呈负相关(r<0,P<0.05),与Th2、IL-4、IL-5、IL-10呈正相关(r>0,P<0.05)。结论AR患儿血清mi R-124-3p表达水平降低,GATA3水平升高,与患儿疾病严重程度和Th1/Th2失衡有关。

氧化苦参碱调控CTLA-4和PD-1缓解小鼠类风湿关节炎的作用

目的 观察氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)通过免疫负调控机制对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)的缓解作用。方法 将DBA/1J小鼠随机分为正常组、模型组、OMT组和地塞米松组,每组9只。采用胶原和佐剂等体积混合背部皮下多点注射诱导DBA/1J小鼠,构建CIA小鼠模型。OMT组和地塞米松组分别用氧化苦参碱和地塞米松进行腹腔注射,正常组注射同等剂量的生理盐水。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测脾淋巴细胞叉头样转录因子P3(forkhead box protein3,Foxp3)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4,CTLA-4)和程序性死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1)的mRNA表达水平。采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察关节滑膜组织的异位生发中心。采用免疫组织化学法和Western blot检测Foxp3及CTLA-4和PD-1的表达。结果 OMT可缓解CIA小鼠关节肿胀度并降低其关节评分,增加脾淋巴细胞和关节组织Foxp3及CTLA-4的表达,降低PD-1的表达(P均<0.05),并减少炎性细胞大面积浸润。结论 OMT可能经增加调节性(Foxp3+)T细胞CTLA-4的表达但降低PD-1的表达而缓解RA。

miR-21-5p靶向JAK/STAT信号通路抑制Th1细胞极化

目的探讨miR-21-5p对1型辅助性T细胞(Th1细胞)极化相关信号通路的调控作用。方法提取小鼠脾单个核细胞,用免疫磁珠阴性分选试剂盒分离初始(naive)CD4^(+)T细胞,用抗小鼠CD3ε,CD28和白细胞介素4(IL-4)单克隆抗体及小鼠IL-12和IL-2混合因子诱导体系诱导初始CD4^(+)T细胞向Th1细胞极化,同时转染miR-21-5p模拟物或模拟物对照,分别命名为Th1诱导组、诱导+模拟物对照组和诱导^(+)miR-21-5p模拟物组,72 h后用流式细胞术检测CD4和干扰素γ(IFN-γ)双阳性(CD4^(+)IFN-γ^(+))细胞百分比;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Th1细胞极化相关关键转录因子和细胞因子mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化相关通路关键蛋白及其磷酸化水平。结合双荧光素酶报告系统验证miR-21-5p作用靶标关键细胞因子IFN-γ、信号通路受体IL-12受体β_(1)(IL-12Rβ_(1))和信号转录与转录激活因子1(STAT1)的表达。结果经免疫磁珠分选获得高表达CD62L的初始CD4^(+)T细胞。与Th1诱导组和诱导+模拟物对照组相比,诱导+miR-21-5p模拟物组CD4^(+)IFN-γ^(+)细胞百分比显著降低(P<0.01);Th1细胞极化相关Janus激酶(JAK)/STAT信号通路关键转录因子STAT1(P<0.01)、STAT4(P<0.05)和T盒21转录因子(T-bet)(P<0.01)mRNA表达显著下调,IFN-γ(P<0.01)和IL-12Rβ_(1)(P<0.05)mRNA表达水平亦显著下调,同时STAT1和STAT4蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结合双荧光素酶报告系统结果表明,miR-21-5p模拟物可分别特异性靶向结合IFN-γ(P<0.01),IL-12Rβ_(1)(P<0.01)和STAT1(P<0.05)基因的3′-非翻译区,而对应靶向位点突变后miR-21-5p模拟物不影响其表达。结论miR-21-5p可靶向下调IFN-γ,IL-12Rβ_(1)和STAT1表达,抑制IL-12和IFN-γ介导的JAK/STAT信号通路活化,从而抑制Th1细胞极化。

肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制研究

目的:探究肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制。方法:将16HBE exo、A549 exo、H522 exo、H460 exo、miR-NC exo、miR-24-3p exo与CD8^(+)T细胞共孵育(16HBE exo组、A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组、miR-NC exo组、miR-24-3p exo组),与PBS共孵育组(PBS组)作为对照,CD8^(+)T与miR-24-3p exo共孵育后转染FGF11质粒(miR-24-3p exo+FGF11组)。CCK8法检测CD8^(+)T细胞的增殖能力。双荧光素酶报告基因实验验证miR-24-3p和FGF11的靶向关系。将各组CD8^(+)T细胞与A549细胞以20∶1的比例共孵育4 h(16HBE exo/CD8^(+)T组、A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组、miR-NC exo/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo/CD8^(+)T组、PBS/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组),Elisa检测共孵育后细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度,LDH法检测CD8^(+)T细胞对A549细胞的杀伤能力。结果:相比于PBS组,A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度显著下降(P<0.001),CD8^(+)T细胞杀伤能力亦显著下降(P<0.001)。双荧光素报告基因检测结果显示FGF11为miR-24-3p的靶基因。miR-24-3p exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著低于miR-NC exo组,miR-24-3p exo+FGF11组CD8^(+)T细胞增殖能力显著高于miR-24-3p exo组(P<0.05)。miR-24-3p exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力均显著低于miR-NC exo/CD8^(+)T组(P<0.001), miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力显著高于miR-24-3p exo/CD8^(+)T组(P<0.001)。结论:肺癌细胞外泌体miR-24-3p可通过靶向抑制FGF11而抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤功能。

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将siMAX、siNC转染3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP 4基因相对表达量,利用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平。【结果】在3T3-L1细胞的成脂分化过程中,与第0天相比,第2、4、6和8天miR-137-3p相对表达量均极显著降低(P<0.01);与NC组相比,miR-137-3p mimics组脂滴明显减少、变小,C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP 4基因相对表达量极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05),C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达下调,miR-137-3p inhibitor组油红O观察结果、成脂分化标志基因mRNA和蛋白表达情况则与之相反。靶基因预测结果表明,MAX的3′-UTR区序列与miR-137-3p存在预测结合位点,且在不同物种间具有高度保守性。双荧光素酶报告试验显示,miR-137-3p mimics组3′-UTR-WT双荧光素酶活性极显著降低(P<0.01);与NC组相比,mimics组MAX基因表达水平极显著降低(P<0.01)、inhibitor组显著升高(P<0.05)。与siNC组相比,敲低MAX基因表达,脂滴明显减少、变小,C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP 4基因mRNA表达水平极显著下调(P<0.01),C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达下降。【结论】内源性miR-137-3p在3T3-L1细胞的成脂分化过程中表达水平降低,miR-137-3p可能通过下调MAX基因的表达抑制3T3-L1细胞成脂分化。

重症急性胰腺炎病人外周血微RNA-143-3p、环氧合酶-2表达水平与辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的关系

目的探究重症急性胰腺炎(SAP)病人血清微RNA-143-3p(miR-143-3p)、环氧合酶-2(COX-2)表达水平与辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的关系。方法选取2017年12月至2020年9月榆林市第一医院诊治的103例急性胰腺炎(AP)病人进行研究,按APACHEⅡ评分将其分为SAP组(45例)和轻症急性胰腺炎(MAP)组(58例),另选取同期55例体检健康者为健康组。比较各组血清miR-143-3p、维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)mRNA、COX-2 mRNA、叉头/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平;分析SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相关性;分析SAP发生的影响因素。结果MAP组、SAP组病人血清miR-143-3p(0.70±0.23、0.42±0.14比1.04±0.35)、Foxp3 mRNA表达水平(0.56±0.19、0.31±0.11比1.03±0.34)及Treg细胞百分比[(6.13±2.04)%、(2.73±0.90)%比(8.74±2.91)%]低于健康组(P<0.05),COX-2 mRNA(1.68±0.48、2.37±0.54比1.01±0.34)、RORγt mRNA表达水平(1.72±0.57、2.44±0.81比1.05±0.35)及Th17细胞百分比[(3.87±1.29)%、(6.71±2.34)%比(1.99±0.66)%]、Th17/Treg(0.63±0.21、2.46±0.82比0.23±0.08)高于健康组(P<0.05);SAP组病人血清miR-143-3p、Foxp3 mRNA表达水平及Treg细胞百分比低于MAP组(P<0.05),COX-2 mRNA、RORγt mRNA表达水平及Th17细胞百分比、Th17/Treg高于MAP组(P<0.05);SAP病人血清miR-143-3p表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清COX-2 mRNA表达水平与Treg、Foxp3 mRNA呈负相关(P<0.05),血清miR-143-3p表达水平与Treg、Foxp3 mRNA及血清COX-2 mRNA表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相关(P<0.05);SAP病人血清miR-143-3p表达水平与COX-2 mRNA呈负相关(P<0.05);miR-143-3p是影响SAP发生的保护因素(P<0.05),COX-2 mRNA、Th17/Treg是影响SAP发生的危险因素(P<0.05)。结论SAP病人血清miR-143-3p表达水平较低,COX-2 mRNA表达水平较高,二者均与Th17/Treg平衡相关,miR-143-3p可能为治疗SAP的新靶点。

lncRNA GATA3-AS1通过靶向miR-361-3p调控T细胞淋巴瘤细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨lncRNA GATA结合蛋白3反义RNA(GATA3-AS)1对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法选取30例胶质瘤组织及相应癌旁组织,体外培养人T淋巴细胞H9和T细胞淋巴瘤细胞Jurkat、CCRF-CEM和SUP-T1,将Jurkat分为si-NC组和si-GATA3-AS1组、miR-NC组和miR-361-3p组、si-GATA3-AS1+anti-miR-NC组和si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p组。RT-聚合酶链反应(qPCR)检测T细胞淋巴瘤组织和细胞中lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p的表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞活性;Transwell检测细胞的迁移和侵袭;Western印迹检测相关蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p的靶向关系。结果T细胞淋巴瘤组织和细胞中lncRNA GATA3-AS1表达水平显著升高,miR-361-3p表达水平显著降低(P<0.05)。与H9组比较,Jurkat、CCRF-CEM和SUP-T1细胞组lncRNA GATA3-AS1表达水平显著升高,miR-361-3p表达水平显著降低(P<0.05)。干扰lncRNA GATA3-AS1表达或过表达miR-361-3p显著降低Jurkat细胞的活性、迁移、侵袭数及细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达水平,显著升高p21表达水平(P<0.05)。lncRNA GATA3-AS1靶向调控miR-361-3p表达(P<0.05)。且下调miR-361-3p逆转了干扰lncRNA GATA3-AS1表达对T细胞淋巴瘤Jurkat细胞增殖、迁移和侵袭的影响(P<0.05)。结论干扰lncRNA GATA3-AS1表达通过靶向上调miR-361-3p抑制T细胞淋巴瘤Jurkat细胞的增殖、迁移和侵袭。

马栗树籽提取物通过miR-155-5p/Th17/Treg轴对过敏性紫癜大鼠炎性反应抑制及肾保护作用的研究

目的观察马栗树籽提取物通过微小核糖核酸(miR)-155-5p/辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)轴对过敏性紫癜(HSP)大鼠炎性反应及肾脏的作用。方法取45只大鼠,随机分为5组:假手术组、模型组和低、中、高剂量治疗组,每组9只。除假手术组外,其余各组采用中西医结合方法建立HSP大鼠模型。激发过敏反应30 min后,进行大鼠腹主动脉取血,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组大鼠血清中相关炎性因子的水平,采用流式细胞术检测外周血中Th17、Treg水平;取皮肤、肾脏组织,观察各组大鼠皮肤及肾脏病理组织学改变,并检测肾脏组织中miR-155-5p mRNA及蛋白表达情况。结果病理学结果显示,假手术组皮肤及肾组织上皮完整、无炎性细胞浸润;模型组可见大量炎性细胞浸润;低、中、高剂量治疗组上述变化均减轻。与假手术组比较,模型组血清相关炎性因子、miR-155-5p和维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)mRNA表达、Th17水平均显著升高,叉头蛋白3(Foxp3)mRNA水平、Treg水平均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量治疗组大鼠血清中相关炎性指标、miR-155-5p和RORγt mRNA表达、Th17水平均显著降低,Foxp3 mRNA水平、Treg水平显著升高(P<0.05)。结论马栗树籽提取物可有效保护HSP大鼠肾脏,抑制HSP大鼠炎性反应,可能通过抑制miR-155-5p/Th17/Treg轴信号通路相关mRNA和蛋白表达及其下游炎性因子发挥调控作用。

碱消解-P&T-GC-AFS法同时测定土壤中的甲基汞和乙基汞研究

建立了碱消解-吹扫捕集-气相色谱-原子荧光光谱法(P&T-GC-AFS)同时测定土壤中甲基汞和乙基汞的分析方法。样品在90℃条件下经氢氧化钾/甲醇消解2.5 h,调节pH为5.40,并丙基化衍生后,采用P&T-GC-AFS法测定。方法对甲基汞、乙基汞的线性相关系数分别为0.999 7、0.999 6,检出限分别为0.26、0.41 ng·g^(-1)。在不同质量浓度水平上进行加标回收率实验,甲基汞、乙基汞的回收率分别为90.5%~93.3%、86.5%~89.6%。该方法样品前处理简单、检出限低,适合批量测定土壤中甲基汞和乙基汞。

基于微小RNA-142-3p与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的相互作用探讨细胞因子在原因不明反复性流产的作用

目的探讨原因不明反复性流产(URSA)过程中微小RNA-142-3p(miR-142-3p)与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的相互作用对细胞因子影响的可能机制。方法选取2016年9月至2017年12月中国科学院大学深圳医院(光明)收治的45例URSA患者纳入流产组,选取同期于中国科学院大学深圳医院(光明)进行检查的40例健康早孕者作为对照组进行回顾性研究。采用流式细胞仪检测两组研究对象外周血中CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞百分比,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Th1型细胞因子与Th2型细胞因子的表达水平。结果流产组研究对象CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞百分比低于对照组(P<0.05);流产组研究对象外周血中白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-4(IL-4)的表达水平低于对照组(P<0.05),而白细胞介素-2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的表达水平均高于对照组(P<0.05);流产组研究对象的IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4比值均高于对照组(均P<0.05);荧光素酶报告基因检测显示,miR-142-3p与CTLA-4具有较强的结合能力。结论miR-142-3p对CTLA-4的表达具有潜在的抑制作用,这可能是促使URSA的机制之一。