急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障损伤、MLCK/p-MLC信号通路活性变化及其与抗菌肽的关系

目的观察急性胰腺炎(AP)大鼠肠黏膜屏障损伤情况和MLCK/p-MLC2信号通路活性变化,探讨MLCK/p-MLC2信号通路激活与抗菌肽的关系。方法将24只SD大鼠分为对照组6只和AP组18只,采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液进行AP造模,对照组仅翻动胰腺后复位。AP组于造模后6、12、24 h各取6只大鼠进行解剖和取材,对照组于造模后6 h取材。采用ELISA法检测血清淀粉酶、脂肪酶水平,HE染色法观察回肠组织病理改变,RT-qPCR法检测回肠组织潘氏细胞分泌的抗菌肽REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表达水平,Western blotting法检测回肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1及MLCK/p-MLC2信号通路相关蛋白MLCK、p-MLC2蛋白表达水平。结果AP组造模后6、12、24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平均高于对照组,其中12 h和24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平高于6 h,且24 h高于12 h(P均<0.05)。对照组回肠黏膜完整,绒毛结构规整正常;AP组回肠黏膜出现不同程度的断裂缺失、间质水肿、炎性细胞浸润。AP组造模后6、12、24 h回肠组织病理学评分均高于对照组,且24 h高于6 h和12 h,12 h高于6 h(P均<0.05)。AP组造模后6、12、24 h回肠组织REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA及ZO-1、Claudin-1蛋白表达水平均低于对照组,且24 h低于6 h和12 h,12 h低于6 h(P均<0.05),造模后6、12、24 h回肠组织MLCK、p-MLC2蛋白表达水平均高于对照组,且12、24 h高于6 h,24 h高于12 h(P均<0.05)。AP组回肠组织MLCK蛋白表达水平与REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平呈负相关(r分别为-0.96、-0.95、-0.93,P均<0.05),p-MLC2蛋白表达水平与REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平亦呈负相关(r分别为-0.96、-0.94、-0.96,P均<0.05)。结论AP大鼠存在肠黏膜屏障损伤,MLCK/p-MLC2信号通路激活参与了AP肠黏膜屏障损伤的过程,该作用可能与潘氏细胞分泌抗菌肽减少相关。

蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血后脑组织ROCK2、RhoA及p-MLC的影响

目的观察蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠神经功能及脑组织ROCK2、RhoA、p-MLC表达的影响,探寻该药防治脑出血的作用机制。方法将96只SD大鼠随机分为假手术组、脑出血模型组、蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组,各组又分为12 h、48 h、3 d、7 d四个亚组,取大鼠自体尾部血注入基底节区以制备脑出血模型,蛭龙活血通瘀组灌胃给药1.2 g/(kg·d),盐酸法舒地尔组腹腔注射给药12 mg/(kg·d),假手术组、脑出血模型组灌胃生理盐水(3 ml/d)。在规定时点对各组大鼠进行NSS评分,采用蛋白质印迹试验(Western blot)检测脑组织ROCK2、p-MLC蛋白表达,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)法检测大鼠脑组织ROCK-2、RhoA mRNA的水平。结果与模型组比较,蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组大鼠NSS评分在各时点均明显减少(P<0.01),脑组织ROCK2、p-MLC蛋白表达在各时点均显著降低(P<0.01),脑组织ROCK2、RhoA mRNA水平各时点均明显下降(P<0.05)。结论蛭龙活血通瘀胶囊可能通过抑制脑出血后脑内ROCK2、RhoA、p-MLC的表达,改善神经功能障碍,从而发挥脑保护作用。

当归芍药散含药血清对ET-1诱导的HSC-T6细胞内p-MLCⅡ,MLCⅡ蛋白表达的影响

目的:探究内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对大鼠肝星状细胞HSC-T6内磷酸化肌球蛋白轻链Ⅱ(phosphorylated myosin light chainⅡ,p-MLCⅡ),肌球蛋白轻链Ⅱ(myosin light chainⅡ,MLCⅡ)蛋白表达的影响及当归芍药散(Danggui Shaoyao San)含药血清对其的干预作用。方法:将HSC-T6细胞种板后,各组每孔加入DMEM和终体积分数分别为2. 5%,5%,10%,15%,20%的空白大鼠血清,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定HSC-T6细胞的活力,筛选出适合的大鼠血清浓度范围;将细胞分为空白血清组(5%,10%,15%)和当归芍药散含药血清组(5%,10%,15%),酶联免疫吸附测定(ELISA)检测基础状态下细胞培养上清液中ET-1的含量;细胞分为空白血清组(10%),当归芍药散含药血清低、中、高剂量组(5%,10%,15%),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基础状态下细胞培养上清液中ET-1 mRNA的水平;将细胞分为空白血清组(10%),模型组(10%),当归芍药散含药血清低、中、高剂量组(5%,10%,15%),Y-27632抑制剂组(100μmol·L^-1),除空白血清组外,其余各组均加入10 nmol·L^-1ET-1诱导HSC-T6细胞,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ET-1诱导的HSC-T6细胞中p-MLCⅡ,MLCⅡ蛋白表达。结果:选用血清浓度为5%,10%,15%作为含药血清浓度。与空白血清组比较,当归芍药散含药血清组明显降低基础状态下ET-1含量,ET-1 mRNA相对含量(P <0. 05,P <0. 01)。与空白血清组比较,模型组细胞内p-MLCⅡ,MLCⅡ蛋白表达水平均显著升高(P <0. 01);与模型组比较,当归芍药散含药血清各剂量组及Y-27632抑制剂组均可明显下调p-MLCⅡ,MLCⅡ蛋白表达(P <0. 05,P <0. 01)。结论:当归芍药散含药血清可能通过下调ET-1的含量,抑制ET-1的自分泌,从而下调p-MLCⅡ,MLCⅡ蛋白表达。

电针对糖尿病神经源性膀胱大鼠肌球蛋白系统的影响

目的观察电针对糖尿病神经源性膀胱(DNB)大鼠肌球蛋白系统的影响,并探讨其效应机制。方法采用高脂高糖饲料喂养结合单次腹腔注射链脲佐菌素制备DNB大鼠模型,将大鼠分为正常组、模型组、电针组和假电针组,每组10只。电针组电针“肾俞”“膀胱俞”“中髎”“三阴交”,连续8周。检测大鼠糖耐量、尿流动力学及膀胱质量,电镜观察膀胱组织线粒体变化,ELISA检测膀胱组织垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)38、环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)含量,Western blot检测膀胱组织磷酸化肌球蛋白轻链激酶(p-MLCK)和磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)表达。结果与正常组比较,模型组大鼠糖耐量降低,膀胱最大容量、膀胱顺应性明显升高(P<0.05),漏尿点压明显降低(P<0.05),膀胱质量明显增加(P<0.05);逼尿肌细胞线粒体肿胀,线粒体嵴断裂或溶解消失;膀胱组织PACAP38、cAMP和PKA含量明显减少(P<0.01),p-MLCK蛋白表达明显降低(P<0.01),p-MLC蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组大鼠糖耐量差异无统计学意义(P>0.05),膀胱最大容量、膀胱顺应性明显降低(P<0.05),漏尿点压明显升高(P<0.05),膀胱质量明显降低(P<0.05);逼尿肌细胞部分线粒体轻度肿胀;膀胱组织PACAP38、cAMP和PKA含量明显增加(P<0.01),p-MLCK蛋白表达明显升高(P<0.05),p-MLC蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论电针可通过激活DNB模型大鼠膀胱PACAP/cAMP/PKA信号通路,调控其肌球蛋白系统相关收缩元件磷酸化水平,修复逼尿肌细胞受损的线粒体,调节能量代谢,改善膀胱肥大,调控膀胱内压和顺应性,修复DNB模型大鼠受损的膀胱功能。

RhoA和肌球蛋白轻链在肝纤维化大鼠肝组织中的表达

目的观察Rho/Rho激酶信号转导通路关键信号分子RhoA和磷酸化肌球蛋白轻链[p-MLC(Thr18/Ser19)]在大鼠肝纤维化组织中的表达规律。方法HE及Masson三色染色观察肝病理组织学变化;用Western blot检测RhoA、p-MLC(Thr18/Ser19)蛋白的表达;RT-PCR方法检测RhoAmRNA的表达。结果随着肝纤维化的进展,RhoA、p-MLC(Thr18/Ser19)蛋白表达明显增加,RhoAmRNA基因表达也逐渐加强。RhoA和p-MLC(Thr18/Ser19)分别与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈显著正相关。结论Rho/Rho激酶信号转导通路在肝纤维化形成过程中发生变化。

散结镇痛胶囊对PGF_(2α)诱发小鼠子宫平滑肌细胞收缩的抑制作用探讨

目的研究散结镇痛胶囊对前列腺素F_(2α)致原代小鼠子宫平滑肌细胞收缩变化的影响,初步探讨其对痛经的治疗作用。原代培养小鼠子宫平滑肌细胞并进行纯度鉴定,给药后监测动态钙离子变化,染色法观察细胞收缩的情况,免疫荧光法测定细胞钙调蛋白(calmodulin,CaM)、肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、磷酸化的肌球蛋白轻链2(phosphorylation of myosin light chain 2,p-MLC_(20))的蛋白表达水平。结果平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色呈强阳性。与PGF_(2α)组比较,散结镇痛胶囊组的钙离子荧光值明显降低(P≤0.05);细胞面积明显增加(P≤0.01);CaM的蛋白表达水平明显降低(P≤0.05);MLCK的蛋白水平有下调趋势;p-MLC_(20)的蛋白表达水平明显降低(P≤0.01)。结论散结镇痛胶囊能治疗痛经,可能与其能抑制平滑肌细胞内钙离子内流,缓解细胞的收缩,降低CaM,p-MLC_(20)的蛋白表达水平有关。

大鼠肝纤维化过程中肝组织磷酸化肌球蛋白轻链表达增加

目的观察Rho信号通路信号分子磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain,p-MLC)在实验性大鼠肝纤维化组织中的表达规律。方法采用胆总管结扎(BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型;分别于手术后1、2、3、4周麻醉动物,假手术组4周麻醉动物,留取肝组织;HE及Masson三色染色观察大鼠肝纤维化的病理组织学变化;用免疫组织化学和Western blot检测p-MLC的表达。结果免疫组织化学显示假手术组p-MLC仅在血管壁呈现弱表达;BDL组随着纤维化发展,血管壁表达增强,并在肝窦周围出现阳性表达细胞。Western blot结果显示随着肝纤维化的进展,p-MLC(Thr18/Ser19)蛋白表达明显增加。p-MLC(Thr18/Ser19)表达分别与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈显著正相关。结论肝维化形成过程中Rho信号通路信号分子p-MLC表达增强。

法舒地尔对肝星状细胞黏附、迁移及胞浆游离钙的影响及机制研究

目的观察法舒地尔(fasudil)通过Rho/Rho激酶(ROCK)信号转导通路对肝星状细胞(HSC)黏附、迁移以及胞浆游离钙([Ca2+]i)的影响。方法将培养的HSC分为5组:对照组;fasudil 12.5μmol/L组;fasudil 25μmol/L组;fasudil 50μmol/L组;fasudil 100μmol/L组。采用甲苯胺兰染色法测定细胞黏附率,Boyden Chamber小室测定HSC跨膜迁移数量,用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检验细胞[Ca2+]i,Western印迹检测HSC磷酸化肌球蛋白轻链〔phosphorylated myosin light chain,p-MLC(Thr18/Ser19)〕和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果Fasudil对HSC的黏附、迁移均具有抑制作用,随着浓度增加,抑制作用加强;fasudil与HSC共同培养后,HSC内[Ca2+]i无明显变化;fasudil抑制HSC的α-SMA表达,并且对Rho/ROCK信号转导通路关键信号分子p-MLC(Thr18/Ser19)的蛋白表达有抑制作用。结论Fasudil通过抑制Rho/ROCK信号通路对细胞骨架的调节作用抑制HSC的黏附、迁移。

周细胞对脓毒症大鼠血管反应性的保护作用

目的观察周细胞(pericyte, PC)对脓毒症大鼠血管舒缩反应性的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔诱导大鼠脓毒症模型,将SD大鼠(12~14周龄,雌雄各半,体质量180~220 g)按随机单位设计方法分为4组(n=16):正常对照组、脓毒症组、常规治疗组(乳酸林格液体复苏+血管活性药多巴胺+头孢呋辛钠)、PC治疗组(PC 106/只+常规治疗),观察不同处理组大鼠肠系膜微动脉舒缩反应性、肠系膜微血管动静脉流速、肝肾血流量及肠系膜上动脉p-MLC20表达的变化。结果与正常对照组相比,脓毒症大鼠血管反应性明显降低(P<0.01);常规治疗可轻微改善脓毒症血管反应性;PC治疗后,脓毒症大鼠微动脉的舒缩反应性、组织器官的灌注量明显改善(P<0.01),肠系膜微动脉的收缩和舒张反应性分别增加至81.5%和86.9%。机制研究发现PC对脓毒症大鼠血管反应性的保护作用与血管p-MLC20有关(P<0.01)。结论 PC通过改善脓毒症大鼠血管收缩和舒张反应性从而实现了对整体器官的保护作用。

磷酸化肌球蛋白轻链及其激酶在耐药颞叶癫癎患者脑组织中的表达

目的探讨耐药性癫癎颞叶和海马脑组织中磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylation of myosin light chain,P-MLC)及其激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表达在癫癎芽生形成中的作用。方法免疫组化检测32例耐药性颞叶癫癎中P-MLC及其激酶MLCK的蛋白质表达水平,并与对照组比较。结果P-MLC免疫组化结果显示,耐药性颞叶癫癎组颞叶光密度值(0.35±0.13)高于对照组(0.19±0.027,P<0.05);耐药组海马光密度值(0.41±0.02)高于对照组(0.10±0.06,P<0.05)。免疫组化结果显示耐药组的MLCK表达水平在颞叶组织和海马组织中较对照组无统计学差异(P>0.05)。结论P-MLC及其激酶MLCK的功能与苔藓纤维芽生关系密切,P-MLC蛋白质产物在耐药性癫中明显升高,但其磷酸化激酶MLCK的表达并不升高,提示MLCK和去磷酸化酶间动态平衡被打破是P-MLC升高的原因,而P-MLC的升高可能在苔藓纤维芽生的形成中发挥重要作用。

人心肌磷酸化肌球蛋白轻链的测定

采用等电聚焦、银染、凝胶光密度扫描技术相结合，分离人心室肌内磷酸化肌球蛋白轻链（ｐ－ＭＬＣ），实验周期短，结果可靠，重复性好，可为临床进行心肌收缩力改变的研究提供直接线索。湿重心肌低于１０ｍｇ时，ｐ－ＭＬＣ难以在等电聚焦板上显示。

磷酸化肌球蛋白轻链在大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化中的表达

目的探讨运用高脂饮食联合小剂量四氯化碳(CCl4)复制大鼠肝纤维化模型的特点,以及磷酸化肌球蛋白轻链[P-MLC(Thr18/Ser19)]在该纤维化模型中的作用。方法 70只SD大鼠随机分为正常对照组(N)、CCl4组(M1)和高脂饮食联合小剂量CCl4组(M2)。N组皮下注射花生油3 ml/kg,2次/周;M1组采用400 ml/L CCl4花生油混合液,3 ml/kg,2次/周皮下注射;M2组采用高脂饮食联合小剂量CCl4造模,其CCl4用量2 ml/kg,浓度和频次同M1组。造模后8周末、10周末分批处死,检测肝功能、血脂、光镜观察大鼠肝脏脂肪变性及肝纤维化程度。免疫组化法检测肝脏P-MLC的表达。结果与N组比较,8周和10周末,M1组血浆球蛋白(GLO)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平,P-MLC的表达及肝脂肪变性,纤维化程度均升高,但白球比(A/G)下降。与M1组比较,8周末,M2组ALT、AST下降,但脂肪变性增强;10周末,M2组白蛋白(ALB)、A/G下降,而ALT、AST上升明显;8周和10周末M2组P-MLC的表达及肝纤维化程度均强于M1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论高脂饮食联合小剂量CCl4皮下注射复制大鼠肝纤维化模型,具有造模时间短,成功率高的优点。P-MLC的表达随着肝纤维化的进展而增加,P-MLC在非酒精性脂肪性肝纤维化中起着一定的作用。

ROCK通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞侵袭中的作用

目的观察肝癌缺失基因1(DLC-1)对HT-29细胞侵袭能力的影响。方法用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-DLC-1转染HT-29细胞;应用Rho激酶(ROCK)特异性抑制剂Y27632处理HT-29细胞;Westernblot检测p-MLC蛋白表达;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果野生型HT-29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系;与对照组及空载组HT-29细胞相比,转染组和ROCK抑制剂组p-MLC蛋白表达均下调,细胞侵袭能力受到抑制(P<0.05)。结论转染DLC-1基因可能通过抑制ROCK活性,从而抑制HT-29细胞的侵袭能力。