酚酸-果胶的酶法制备及其抗氧化与抑菌活性

本研究旨在探索酶促接枝改性对果胶结构和功能性质的影响,为开发具有生物活性的新型食品包装材料提供科学依据。以脂肪酶为催化剂,分别将对羟基苯甲酸和没食子酸接枝到果胶分子上。采用1H NMR、FTIR和XPS等分析技术对改性果胶的结构进行表征,并评估其抗氧化和抗菌活性。结果表明,对羟基苯甲酸修饰果胶(Hb-Pe)和没食子酸修饰果胶(Ga-Pe)的接枝率分别达到21.8%和22.9%。同时,与未改性果胶相比,Ga-Pe表现出显著(P<0.05)提高的DPPH自由基清除能力(69.6%)和β-胡萝卜素漂白抑制能力(65.5%),而对羟基苯甲酸改性果胶Hb-Pe的抗氧化活性提升有限,两项指标仅分别为5.54%和28.6%。此外,两种改性果胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为15.7、13.3 mm(Hb-Pe)和16.6、12.6 mm(Ga-Pe),均显著(P<0.05)高于未改性果胶的抑菌效果。本研究证实了酶促接枝改性能够有效提升果胶的生物活性,为延长食品保质期提供了新的思路。

枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipaseA突变文库构建及其生物柴油转酯研究

采用易错PCR方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipase A进行定向进化,并首次采用对硝基苯棕榈酸酯(p NPP)法进行96孔板高通量筛选。结果表明:第一轮易错PCR没有产生随机突变,第二轮易错PCR反应在Mn^(2+)浓度为0.2 mmol·L^(-1)时,产生了突变菌株。对该条件下构建的文库中124株突变菌株进行p NPP高通量筛选,突变株4B_2的吸光度值A_(405)为1.395,与未突变株PET32a-lipase A(A_(405)=0.448)差异显著。测序结果表明,突变株4B_2脂肪酶基因lipase A有5个核苷酸位点发生了突变,其中3个是同义突变,2个是错义突变,分别是82位的天冬酰胺(AAU)突变为酪氨酸(UAU),143位的赖氨酸(AAG)突变为苏氨酸(ACG)。突变株4B_2发酵上清液转化生物柴油的转酯效率较对照菌PET 32a-lipase A有明显提高,前者为79.5%,后者为49.72%。本研究为枯草芽孢杆菌脂肪酶lipase A转酯活性位点的探索奠定了基础。

新型脂肪酶LipB52催化生物柴油

一种来源于荧光假单胞菌的新型脂肪酶基因lipB52在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,并且利用Ni-NTA亲和柱对脂肪酶LipB52进行纯化。采用固定化脂肪酶LipB52催化大豆油与甲醇的转酯反应生产生物柴油。实验考察了温度、底物摩尔比、酶用量、有机溶剂、酶的种类以及油的类型对于反应的影响,结果表明:转酯反应的最佳反应条件为:m(酶)∶m(油)=20∶80,n(油)∶n(甲醇)=1∶4、正庚烷作为溶剂、反应温度为30℃,在此条件下脂肪酶LipB52表现出很高的催化活性,反应40 h后甲酯的产率高达92%。

PDA／SiO2大孔复合材料固定化荧光假单胞菌脂肪酶

以具有三维骨架结构的大孔聚合物为模板制备SiO2大孔材料，通过多巴胺在SiO2大孔材料孔道表面的原位聚合制得聚多巴胺表面功能化修饰的二氧化硅大孔材料（PDA/SiO2）。应用SEM、EDX、MIP、BET、TG—DTA和FTIR等技术对修饰前后的材料进行表征。以PDA／SiO2为载体固定荧光假单胞菌脂肪酶（PFL）．优化固定化条件并对比游离脂肪酶和固定化脂肪酶的性质。结果表明SiO2大孔材料具有三维连续贯通的孔道结构，孔径分布在300～500nm，聚多巴胺修饰后形成聚多巴胺／二氧化硅复合纳米薄膜构筑的大孔材料。在固定化时间为14h、pH值为8、初始脂肪酶浓度为0．4mg·mL-1时，固定化效果最佳，酶活回收率达246％。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶有更宽的温度和pH适用范围、热稳定性显著提高，并展现出良好的储存稳定性和操作稳定性。固定化脂肪酶的Km低于游离脂肪酶的，酶与底物的亲和性较好。

脂肪酶催化外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯水解制备对映体纯D-对羟基苯甘氨酸的新方法

基于在反应体系中添加碳酸氢铵可有效地促进酶促外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯不对称水解这一有趣现象的发现 ,探讨了利用有机介质中酶促外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯不对称水解制备对映体纯 D 对羟基苯甘氨酸及其衍生物的可能性 ,研究了不同来源的酶、摇床转速、水含量、对羟基苯甘氨酸甲酯浓度、反应介质及温度等因素对该反应的影响 .结果表明 ,在所研究的 11种酶中脂肪酶Novozym 4 35对该反应的催化活性和对映体选择性较高 ,叔丁醇为最合适的反应介质 ,最适水含量为0 4 % (V/V) ,对羟基苯甘氨酸甲酯的适宜浓度为 2 0mmol/L ,最适摇床转速和反应温度分别为 130r/min和 30℃ .在此优化条件下反应 2 6h后 ,底物转化率和产物ee分别为 39 8%和 95 2 % .

荧光假单胞菌脂肪酶固定化及催化制备生物柴油的工艺研究

研究了不同因素对制备固定化荧光假单胞菌脂肪酶的影响及固定化酶的酶学性质,并初步探讨了利用该固定化酶制备生物柴油的工艺。以海藻酸钠明胶为复合载体,采用包埋法制备固定化荧光假单胞菌脂肪酶,考察了载酶量、颗粒直径等因子对固定化效果的影响,并用制备的固定化酶进行了酶促酯交换合成生物柴油的工艺研究,考察了反应条件如酶量、反应温度、甲醇流加方式、醇油比等因素对甲酯得率的影响。试验结果表明,制备固定化荧光假单胞菌脂肪酶的最优条件为:每克载体给酶量为300 IU,选用6号注射器针头(内径为0.5 mm);通过酯交换,催化大豆油合成生物柴油的最佳反应工艺参数为:固定化酶25%,醇油比4:1,含水量6%,反应温度40℃;此条件下反应35 h后,甲酯的最高得率可达82%。

大黄鱼腐败菌的低温致腐性及相互作用

以挥发性盐基氮、三甲胺和气味指纹图谱为表征,探讨腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)、静止嗜冷杆菌(P.immobilis)和荧光假单胞菌(P.fluorescens)在低温下对鱼肉的腐败性以及混合菌群在致腐过程中的相互作用.研究结果表明,腐败希瓦氏菌具有较强的产挥发性盐基氮特性,主导腐臭气味;荧光假单胞菌具有类似的腐败趋势,但腐败性较腐败希瓦氏菌弱;静止嗜冷杆菌不具有显著的产挥发性盐基氮等特性,但能产生更为复杂的气味;荧光假单胞菌和静止嗜冷杆菌在腐败初期对腐败希瓦氏菌的腐败趋势有抑制作用.

腾冲菌脂肪酶的表达纯化及酶学性质的表征

将来自腾冲菌的脂肪酶（LipA）基因（lipA）克隆到大肠杆菌表达载体pET28a（含T7启动子）和pTrc99A （含Trc启动子）中，转入大肠杆菌表达，发现Trc启动子更适合LipA的表达。通过热处理和DEAE-Sepharose阴离子柱纯化过程，重组LipA得到纯化，比酶活达到1.9U/mg，重组LipA分子量为42kDa。重组LipA在80℃、pH 4.5时酶活最高，经85℃保温2h，酶活保持60%以上；在pH值4.0～6.0之间，LipA具有较好的稳定性；Cu^2＋和Zn^2＋对酶活力分别有38.9%和69.2%的抑制作用，Mn^2＋、Co^2＋和Tween-20对该酶有较大的激活作用；以p-nitrophenyl-laurate （p-NP-C12）为底物时，该酶的Km值为1.5mmol/L，kcat为34.5s-1。

酶法低盐保温白腐乳后酵工艺条件的研究

该实验采用正交表L2 7(3 13 )安排白腐乳后期发酵工艺条件 ,探讨了在后期发酵过程中蛋白酶、NaCl、酒精度、脂肪酶和时间等五个因子对腐乳产氨基酸指数的影响情况。通过正交二次多项式的回归分析 ,得出了各因子与氨基酸态氮产量间的经验定量公式。优化结果表明 ,采用酶法低盐保温后期发酵新工艺 ,能将后期发酵时间缩短到 10～ 12天 ,即可生产出氨基酸态氮含量高达 1 75 g/ 10 0 g (干基 )的白腐乳 ,其质构。

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）G63。运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因（lip A）及其伴侣基因（lipB）。该脂肪酶基因开放式阅读框（ORF）为1092bp，编码364个氨基酸残基。经KpnI／HindiⅢ酶切，将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上，构建成质粒pBBR1-lipAB。通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，转入原宿主菌P．cepaciaG63中，构建成洳A基因同源高效表达的基因工程菌。该菌株在连续转接5次，培养45h后质粒保持率为82．6％，适用于规模化发酵生产。摇床发酵表明，工程菌在60h时酶活达到150．63U／mL，较原始菌株提高3．6倍。

3种血清学指标与系统性红斑狼疮性肾炎的关系

目的探讨3种血清学指标,抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)、抗核糖体P蛋白抗体(anti-P)和抗脂蛋白酶抗体(anti-LPL)与系统性红斑狼疮(SLE)性肾炎的关系。方法分析该院自2001年以来71例SLE患者各主要相关血清学指标与SLE肾炎的关系。结果SLE肾炎anti-dsDNA、anti-P和anti-LPL有较高的阳性率,而且它们之间存在较高的协同相关性(P<0.05)。结论anti-LPL的升高和anti-LPL与anti-P的协同相关性,及anti-LPL与anti-dsDNA的协同相关性可以作为诊断SLE肾炎的依据。

棉织物上SESA活化法固定化脂肪酶工艺的研究

研究了对 β 硫酸酯乙砜基苯胺活化法在棉织物上固定化脂肪酶的工艺条件 ,并考察了固定化酶的最适作用温度和pH及间歇操作稳定性。最佳固定化条件为 :醚化pH为 10 0 ,偶联pH为 7 0 ,脂肪酶的浓度为 6mg ml,偶联时间为 12h ,所得固定化脂肪酶的最大活力为 35U g(棉 )·min。固定化酶的最适作用温度为 35℃ ,最适pH为 8 0 ,半衰期为 6d。

一株低温碱性脂肪酶产生菌TS182的分离与鉴定研究

通过Tween-80平板初筛和摇瓶发酵复筛,从连云港海域海水及海泥样品中分离的菌株中筛选获得一株低温碱性脂肪酶高产菌株TS182。通过形态学、生理生化以及分子生物学鉴定菌株TS182为荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)。菌株TS182所产脂肪酶最适温度和最适pH分别为15℃和9.0。

P(3HB-co-4HB)/PBS共混材料酶解性能研究

目的研究P(3HB-co-4HB)/PBS共混材料在脂肪酶溶液中的生物降解性能。方法将P(3HBco-4HB)/PBS共混材料置于脂肪酶溶液中进行酶解实验,利用质量损失率、扫描电镜(SEM)、X射线衍射(X-RD)和偏光显微镜(POM)等测试手段或指标,对材料的生物降解性能进行分析。结果质量损失率与SEM结果表明,实验用脂肪酶对P(3HB-co-4HB)的降解效果不明显,而对PBS有着较为显著的降解效果。X-RD分析表明,P(3HB-co-4HB)/PBS共混材料在19.9°和22.7°处的结晶衍射峰强度随酶解时间不断下降,表明主要是PBS组分发生了降解。POM结果表明,P(3HB-co-4HB)酶解前后球晶的形态基本不变。结论实验用脂肪酶对PBS酯键的水解相对容易,而对P(3HB-co-4HB)酯键的水解难度较大,P(3HB-co-4HB)/PBS共混材料在酶解时,存在PBS优先降解的情况。脂肪酶酶解对材料的晶区与非晶区并没有选择性。

染料木黄酮抑制3T3-L1细胞成脂分化机制

目的：研究染料木黄酮是否通过雌激素受体介导影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化,并探讨其可能的机制。方法：以不同浓度染料木黄酮处理3T3-L1细胞,四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法测定细胞存活率;在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中分别加入不同浓度染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780（一种雌激素受体抑制剂）混合物及不同浓度雌二醇,油红染色观察分化结果,测定细胞甘油三酯（triglyceride,TG）含量;染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780混合物及不同浓度雌二醇处理诱导成熟后的脂肪细胞,测定培养液甘油含量;分别用染料木黄酮（30μmol/L）、染料木黄酮（30μmol/L）和ICI182780混合物干预细胞成脂分化,Western blotting法检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、p-ERK、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）蛋白表达量。结果：3T3-L1细胞存活率随染料木黄酮浓度的升高而降低,50-200μmol/L染料木黄酮能抑制细胞生长（P〈0.01）;染料木黄酮能负向调节成脂分化后细胞胞浆内TG含量,在0-50μmol/L浓度范围内呈剂量依赖关系,高剂量雌二醇（100 nmol/L）能下调TG含量;染料木黄酮能促进成熟脂肪细胞脂解,提高细胞培养液甘油浓度;染料木黄酮（30μmol/L）能上调p-AMPK、HSL蛋白表达,下调FAS蛋白表达（P〈0.01）,对ERK、p-ERK、AMPK表达量无明显影响（P〉0.05）。ICI182780（1μmol/L）能部分阻断染料木黄酮（30μmol/L）对p-AMPK的调节作用（P〈0.05）。结论：染料木黄酮能抑制3T3-L1细胞成脂分化,其机制可能是染料木黄酮一方面下调FAS蛋白表达,抑制脂肪合成,另一方面激活AMPK-HSL途径促进脂肪分解;染料木黄酮还可能通过非雌激素受体途径抑制3T3-L1细胞成脂分化。

导入脂肪酶基因提高荧光假单胞菌26-2的产酶效率

采用导入脂肪酶基因的方法对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)26-2的产酶效率进行实验。实验以质粒ppic9k-lipA为模板,通过PCR的方式在26-2脂肪酶基因的两端引入BamH1和EcoR1的酶切位点,并将该基因与大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pDSK519连接,获得重组质粒pDSK519-lipA,再将重组质粒转入荧光假单胞菌26-2,获得工程菌株P.f luorescence26-2-1。在相同的发酵条件下,工程菌株的发酵液酶活力比原始菌株的发酵液酶活力提高2倍,实现了荧光假单胞菌脂肪酶基因的同源性表达。

固定化脂肪酶催化合成丙二酸单对硝基苄酯

以脂肪酶为催化剂,在甲苯介质中直接催化丙二酸和对硝基苄醇合成丙二酸单对硝基苄酯,并对酶法合成反应条件进行优化。确定最佳反应条件为：以甲苯为介质的20 mL反应体系中,Novozym435质量浓度为3 g/L,对硝基苄醇质量浓度为4 g/L,对硝基苄醇与丙二酸摩尔比为4∶5,反应温度为50℃,反应时间为8 h,丙二酸单对硝基苄酯收率达到最大值873%。Novozym 435重复使用6次后,丙二酸单对硝基苄酯收率约为70%。丙二酸单对硝基苄酯的结构组成通过核磁共振氢谱（^1H NMR）进行了表征和确认。

纳米TiO_2对鸡肉源微生物的光催化抑菌效果研究

[目的]研究不同作用因素对纳米TiO_2的光催化活性影响,为纳米TiO_2光催化杀菌技术的开发与应用提供参考。[方法]以菌液初始浓度、光照强度和纳米TiO_2浓度为主要变量因素,研究不同因素条件下纳米TiO_2对鸡肉源微生物P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用效果。[结果]纳米TiO_2浓度增加对P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用呈先升高后降低的趋势,最佳浓度值为0.4 g/L;增高光照强度,降低初始菌液浓度,纳米TiO_2的光催化抑菌效果增强;相同试验条件下,纳米TiO_2对P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用一致,对M.caseolyticus的抑菌率始终低于P.fluorescens。[结论]M.caseolyticus对纳米TiO_2的光催化作用比P.fluorescens更加敏感。

脂肪酶活力测定方法及其比较

目前脂肪酶活性测定方法主要有平板法、滴定法和比色法,其中比色法又包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法.本文对上述方法的精确度,所需实验仪器、试剂及费用,操作方法的难易程度进行系统的比较,并得出各种方法的优缺点及应用范畴.