半夏测土配方施肥产量效应和氮磷钾吸收特性分析

目的:探索肥效对贵州半夏产量及养分吸收特性的影响。方法:采用“3414”测土配方施肥考察半夏产量及不同时期块茎对氮磷钾吸收特性,SPSS 22.0进行肥效方程拟合及不同时期块茎氮磷钾吸收的显著性分析。结果:氮、磷、钾肥施用量的变化对半夏产量具有显著相关性,通过对氮、磷、钾肥施用量与半夏产量的关系拟合得到单因素肥效方程、三因素肥效模型以及不同时期块茎吸收氮磷钾与产量的相关性模型,该区域半夏最佳施肥策略为氮肥74.19 kg/hm^(2)、磷肥87.28 kg/hm^(2)、钾肥25.48 kg/hm^(2);不同时期块茎对氮的吸收受磷肥施用的影响,当磷肥施用处于较高水平时,块茎对氮的吸收也处于较高水平;块茎对磷的吸收受钾肥施用的影响,当钾肥施用处于较低水平时,对磷的吸收处于较高水平;块茎对钾的吸收则受氮、磷施用的共同影响,高钾的施用有利于块茎对钾的吸收。结论:半夏不同生长期应采取不同的施肥策略以达到更高的产量,本研究对贵州半夏高产栽培有一定指导意义。

半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究

研究了半夏凝集素(Pinellia ternataagglutinin,PTA)基因对桃蚜(Myzus persicae)的抗性。从半夏幼叶中提取总RNA,采用RT-PCR法分离克隆出PTA1基因cDNA片段,该基因在GenBank中登录号为DQ092435。序列分析表明:该cDNA片段全长为810bp,编码269个氨基酸组成的蛋白,具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,含有3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点,与报道的天南星科凝集素基因氨基酸序列的同源性在72.7%~92.9%。构建了35S启动子控制下的PTA1基因的植物表达载体pBI121PTA1,该载体含有抗卡那霉素的选择标记基因(nptⅡ),利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明:PTA1基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明:转基因植株有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率达77.02%,表明该基因对同翅目害虫的抗虫基因工程有重要的应用价值。

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的 将外源半夏凝集素基因 ( PTA )转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法 构建了以 Ca MV 35 S为启动子 ,新霉素磷酸转移酶 ( Npt- )为选择标记 ,带有半夏凝集素基因 PTA的 p CAMB A2 2 0 0植物双元表达载体 ,应用根癌农杆菌 EHA 10 5遗传转化四倍体菘蓝。结果 菘蓝外植体植株再生率达到 95 %以上 ,转化率有10 %。结论 建立了以 6 - BA和

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应 (PCR) ,Southern杂交和 RT-PCR检测。结果 PCR和 Southern杂交检测结果表明 ,外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中 ,RT-PCR结果表明其 DNA可以正常转录成 m RNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。

半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用

采用同源序列克隆方法，通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1069bp的半夏凝集素基因pta，与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高，达到98％以上，功能区完整，具有1条信号肽和3个甘露糖结合区，GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因，正向插入35S启动子之下，构建了植物表达载体pBI—pta。通过农杆菌介导法转化烟草，从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株，证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫（Myzus persicae）筛选试验，结果表明：不同株系蚜口密度抑制率在22．5％～89．4％，平均蚜口密度抑制率56．2％。

十六倍体三叶半夏品种特性的分析

利用三叶半夏悬浮细胞为材料,通过秋水仙素诱导后获得稳定的半夏多倍体株系。通过染色体鉴定、生理分析以及药典规定项目的测定,综合考察半夏多倍体株系的品种特性,评价其作为新品种的潜力。结果表明:优良半夏株系为八倍体三叶半夏,加倍后的半夏为染色体加倍的十六倍体半夏。与八倍体半夏相比,十六倍体半夏在形态学方面表现出植株矮壮,叶片变圆变厚,块茎增大的特点,细胞学方面表现出气孔密度降低,保卫细胞增大,叶绿体个数增多的现象。经过种植实验得出结论:十六倍体半夏生长期延长,抗逆性增强,夏季基本不倒苗,并且块茎个体均一,品质较好,总体产量增加。对十六倍体半夏块茎进行测定比较后发现,十六倍体半夏符合药典中规定的各项定性和定量指标规定。由此可见,通过半夏的单细胞进行多倍体的诱导是一种可行的方案,并且诱导得到的十六倍体为抗性增强、产量提高,且符合药典规定的半夏新品系。

利用农杆菌介导法将抗虫基因和高赖氨酸蛋白基因导入超级杂交水稻亲本材料1826中

超级杂交水稻的培育、推广和应用可显著提高水稻的单位面积产量,但许多超级杂交水稻存在抗虫能力较低、品质较差的问题。1826是一个优良的超级杂交水稻亲本材料,但抗褐飞虱能力低,必需氨基酸赖氨酸的含量低。本研究利用基因工程技术将CaMV 35S启动子引导的半夏凝集素基因(PTA)和水稻胚乳特异表达启动子(Glutelin-B1 promoter)引导的马铃薯高赖氨酸蛋白基因(SB401)同时转入1826成熟胚诱导的愈伤组织中,获得了同时含PTA和SB401的转基因植株。本研究为提高1826的抗褐飞虱能力和赖氨酸含量打下了基础。

狭叶半夏和普通半夏总生物碱含量比较

目的 比较狭叶半夏和普通半夏总生物碱含量。方法 重量法和酸性染料比色法。结果 重量法和酸性染料比色法均测得狭叶半夏总生物碱含量高于普通半夏。结论 总生物碱含量上的差异反应了二者品质上的优劣 。

三叶半夏离体块茎诱导研究

采用不同激素浓度梯度水平和配比进行试验,以筛选三叶半夏进行离体块茎诱导的最佳培养基配比。试验结果表明:叶片、叶柄和丛生芽可直接诱导产生块茎,MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA为三叶半夏叶片、叶柄和丛生芽诱导离体块茎的共同最佳培养基激素浓度配比,其中叶柄和丛生芽较之叶片更易于诱导产生块茎。

半夏种内各变异类型主要形态学性状比较研究

目的为半夏各变异类型提供形态学的鉴别和分类依据。方法系统观察并测量各变异类型主要形态学性状,采用多角形图比较其相似性和差异性程度。结果生殖器官中,各变异类型间各性状的差异性较小,但有一个变异趋势,即阔叶类型的雌雄花序长和宽,雌雄间隔,管部长和宽与其它类型相比,数值略小。营养器官中,以叶片长宽比值即叶形的变化最为明显,其它性状在各变异类型间相似。结论叶片长宽比值在各变异类型间差异显著,可作为各变异类型鉴别和分类的依据。

半夏药材中蛋白质IEF电泳图谱的研究

目的通过对半夏及其近缘植物的蛋白质电泳图谱比较,研究半夏药材的电泳鉴别方法。方法应用等电聚焦(isoe lectrofocus ing,IEF)技术,对不同产地半夏及其近缘植物块茎进行比较。结果半夏具有稳定的IEF电泳图谱,显示具有8条特征蛋白质带,并测定了其等电点(P I)值,半夏与其几种近缘植物的IEF谱有明显的区别。结论半夏IEF电泳图谱可作为半夏药材的鉴别依据,半夏特征蛋白质的P I值为半夏的鉴定和蛋白质分离纯化提供了参数。

半夏与其伪品掌叶半夏的RAPD鉴别

目的建立半夏及其伪品掌叶半夏的快速简单的分子鉴定方法。方法 SDS法提取半夏和掌叶半夏的基因组DNA,20个10碱基随机引物(S1-S20,上海生工)用于RAPD-PCR分析。结果 20个引物中有7个有效稳定的引物在半夏和掌叶半夏之间能显示出多态性指纹图谱,其中S10和S17在半夏和掌叶半夏之间显示较大差异。结论利用引物S10和S17进行RAPD-PCR能有效鉴别半夏和掌叶半夏。

半夏生物碱对豚鼠离体回肠5-HT_3受体与NK_1受体的影响

目的 :观察半夏生物碱对不同工具药干预下豚鼠离体回肠运动的影响,探讨其防治化疗性恶心呕吐的机制。方法 :分别以5-羟色胺(5-HT)、选择性5-HT_3受体激动剂2-甲基-5-羟色胺(2-Methylserotonin,2-Methyl-5-HT)、P物质(substance P,SP)和选择性NK_1受体激动剂GR73632作为工具药,利用离体恒温浴槽,观察半夏生物碱在上述工具药存在条件下对豚鼠离体肠管收缩的影响。结果:半夏生物碱可以拮抗5-HT及选择性5-HT_3受体激动剂2-Methyl-5-HT、SP及选择性NK_1受体激动剂GR73632对肠管的兴奋作用,使肠管收缩张力显著降低,并且对上述4种受体激动剂的拮抗作用呈现一定程度的剂量依赖性。结论:半夏生物碱对回肠上的5-HT_3受体与NK_1受体具有一定阻断作用。半夏生物碱是半夏止吐的主要有效部位,阻断5-HT_3受体与NK_1受体可能是半夏防治化疗性恶心呕吐的重要机制之一。

半夏与其混伪品掌叶半夏SCAR标记鉴别研究

目的:建立快速准确的半夏和掌叶半夏分子标记鉴定方法。方法:通过RAPD随机引物的筛选,获得半夏特异的RAPD分子标记片段,经克隆、测序,重新设计特异性引物转化形成稳定的SCAR标记。结果:获得1条稳定扩增的半夏特异片段T350,根据该特异片段序列设计1对特异引物,分别对半夏和掌叶半夏DNA进行扩增,引物可从半夏DNA中扩增获得约330bp的片段,而掌叶半夏未扩增出该片段。结论:T350成功转化为SCAR分子标记,可对半夏和掌叶半夏进行快速有效的鉴定。

半夏种内不同变异类型生长节律的比较

[目的]观测研究半夏种内不同变异类型的生长节律。[方法]对半夏种内椭圆形叶半夏、细叶形半夏和4—5叶半夏3种变异类型定期取样进行调查测定，观察其生长节律。[结果]半夏生育期划分为5个时期：出苗期、全苗期、珠芽发笙期、佛焰苞集中出现期以及倒苗期。4～5叶半夏具有出苗率高，出苗较为整齐，珠芽数目多，倒苗率低等优良性状。各类型的佛焰苞发生率和结实率均较低。[结论]今后可着重将4—5叶半夏作为人工栽培的一个主要类型，并作为半夏优良种质进一步选育的方向。

白肋烟转基因育种研究

利用农杆菌介导法将具有广谱抗病的葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GO)基因及抗虫半夏凝集素(Pinella Ternata Agglutinin,PTA)基因转化到烟草中,并研究了影响转化和抗性植株再生的一些因素。结果表明,基因型是影响转化和抗性植株再生的关键因素,试验所用的3个品种KY14、KY8959、TN90中,KY14转化效率最高。用于烟草转化的侵染时间以15min为宜,共培养时间以2d最佳。PCR分子检测表明,外源GO基因及PTA基因已转入到烟草KY14中。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢,证实GO基因已经在烟草中发挥功能。

半夏凝集素蛋白与半夏毒针晶毒性的相关性研究

目的:研究半夏凝集素蛋白与半夏毒针晶毒性的相关性,揭示半夏产生毒性的机制。方法:采用大鼠腹腔炎症模型,以腹腔渗出液中PGE2含量为指标,研究半夏凝集素致炎作用的量-毒、时-毒曲线;采用家兔眼结膜刺激模型,以眼结膜的病理切片观察半夏凝集素与半夏毒针晶刺激性的相关性。结果:半夏凝集素可引起大鼠腹腔渗出液中PGE2、蛋白含量显著提高,呈剂量依赖性;半夏凝集素可显著加重半夏毒针晶对家兔眼结膜的刺激性,且随着半夏凝集浓度的升高,刺激性显著增强,但单给药半夏凝集素对家兔眼结膜无刺激性。结论:半夏凝集素蛋白具强烈的致炎作用。半夏产生强烈炎症刺激的机制是半夏刺入机体,凝集素蛋白随针晶进入机体组织,诱导炎症反应发生而产生刺激性。

半夏、掌叶半夏及禹白附凝集素蛋白的刺激性研究

目的:研究半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin,PTA),掌叶半夏凝集素(Pinellia pedtaisecta agglutinin,PPA),禹白附凝集素(Typhonium giganteum agglutinin,TGA)的刺激性作用。方法:SD雄性大鼠随机分为空白组,PTA,PPA及TGA高中低剂量组(300,200,100 mg.L-1),ip给药,4 h后处死大鼠,ip生理盐水,取腹腔液测中性粒细胞迁移数目,测定腹腔液中总蛋白,一氧化氮(NO),前列腺素E2(PGE2)的含量;家兔随机分为空白组,半夏,掌叶半夏及禹白附的凝集素组及毒针晶组,半夏,掌叶半夏及禹白附的针晶加其凝集素组,观察家兔眼结膜充血,水肿及分泌物,考察PTA,PPA,TGA的刺激性作用。结果:大鼠ip PTA,PPA,TGA后,与空白组腹腔液中性粒细胞迁移数目(633.33±233.81)×106/L比较,100 mg.L-1组PTA(1 083.33±116.9)×106/L,PPA(1 033.3±150.55)×106/L及TGA(1 133.33±103.28)×106/L均具极显著性差异(P<0.01),均可引起严重的中性粒细胞向腹腔迁移,且浓度升高,作用增强;大鼠腹腔液的总蛋白,NO及PGE2的含量显著升高,均可加重针晶刺激家兔眼结膜强烈水肿。结论:天南星科中具有刺激性毒性作用的半夏,掌叶半夏及禹白附所含凝集素蛋白具有刺激性作用,是其毒性刺激性成分。

半夏及掌叶半夏毒针晶中共性毒蛋白的研究

目的:寻找天南星科半夏属有毒中药半夏及掌叶半夏毒性物质基础毒针晶中的共有蛋白,研究刺激性相关蛋白的致炎效应。方法:采用溶液内双酶解方法将半夏与掌叶半夏毒针晶中的蛋白降解为混合肽段,采用液相色谱与串联质谱偶联分析降解后的肽段,将质谱分析数据与BIOWORKS软件搜索的NCBI绿色植物Viridiplantae蛋白库比对进行蛋白质检索分析。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对半夏、掌叶半夏毒针晶蛋白进行分析,同时采用胶内酶解后液相色谱与串联质谱偶联的方法,分析并鉴定约13kDa蛋白。提取分离半夏中的凝集素蛋白,并采用中性粒细胞迁移试验和测定腹腔渗出液中PGE2的含量,考察毒针晶及凝集素的炎症刺激性效应。结果:半夏及掌叶半夏毒针晶中均含约13kDa的蛋白条带,此条带经鉴定为凝集素类蛋白,且此13kDa蛋白条带为毒针晶中的主要蛋白之一,凝集素类蛋白可诱导中性粒细胞向大鼠腹腔迁移,可显著增加小鼠腹腔渗出液中PGE2的含量。结论:天南星科有毒中药半夏及掌叶半夏毒针晶蛋白中均含有凝集素类蛋白,且此类凝集素蛋白具有显著的致炎作用,是半夏与掌叶半夏毒针晶中的共性毒蛋白。

半夏凝集素基因的克隆、生物信息学分析及其蛋白的亚细胞定位

目的克隆半夏凝集素基因,并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位。方法以半夏Pinellia ternata新鲜叶片的DNA为模板,根据Genbank上的半夏凝集素的基因序列(GU593718.1)设计引物,克隆了半夏凝集素(PTA)基因,并构建植物表达载体pI1300-CaMV35S-PTA-GFP,在农杆菌GV3101中进行表达且观察了其在烟草中瞬时表达。结果所克隆的PTA的开放阅读框为810 bp,其编码269个氨基酸;具有1条信号肽、2个B-lectin保守区域和3个甘露糖结合基序;PTA氨基酸序列与NCBI中所报道的半夏、掌叶半夏P.pedatisecta、滴水珠P.cordata凝集素的氨基酸序列的同源性分别达到97%、85%和83%;初步推测其定位于膜上,现已在NCBI中登记(登录号KF154979)。结论本实验通过对半夏凝集素的生物信息学分析和亚细胞定位分析,为进一步研究半夏凝集素的抗病虫害机制奠定了基础。