牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDVP20及P14基因,并将其插入到pET-28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3)宿主菌中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测,pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白,pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白,结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达,表达出的蛋白大小与预期结果相符.

肝细胞癌组织STAT3和p14^(ARF)蛋白的表达和相关性研究

目的探讨STAT3和p14ARF蛋白在人肝细胞癌组织中的表达及相关性,分析其与肝细胞癌转移复发的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测60例肝细胞癌组织和癌旁组织中STAT3和p14ARF蛋白的表达情况。结果 STAT3及p14ARF蛋白在60例肝细胞癌及癌旁组织中的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。STAT3的表达与脉管癌栓、术后复发、肿瘤直径、肿瘤细胞分化密切相关(P<0.05);p14ARF蛋白的表达与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05)。STAT3和p14ARF蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.325,P=0.011)。结论 STAT3和p14ARF蛋白在肝细胞癌的发生及发展中起着重要作用。

HCV肝炎肝硬化中核心蛋白、p14^(ARF)和p21^(WAF1)的表达

目的 检测HCV肝炎、肝硬化组织中的核心蛋白、p14ARF、p21WAF1的表达及其相关性,探讨HCV核心蛋白对p14ARF、p21WAF1的表达作用。方法 收集HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织23例,采用免疫组织化学EnVision两步法检测HCV感染的肝炎、肝硬化组织的核心蛋白、p14ARF、p21WAF1的表达,并分析三者间的关系。结果 核心蛋白、p14ARF、p21WAF1的阳性表达主要定位于细胞核。在核心蛋白均阳性的组织中,p14ARF的阳性表达率为69.6%,p21WAF1表达率为13%;三组间的阳性强度比较,差异有显著性(P=0 .01),HCV核心蛋白与p14ARF、p21WAF1各组间的P值均<0. 01;HCV核心蛋白与p14ARF、p21WAF1阳性强度两者间相关性检验,相关系数rs分别为-0 .053、0 .45(P值分别为0 .72、0. 20),表明无相关性。结论 HCV核心蛋白对p14ARF、p21WAF1的表达有影响:可能间接促进p14ARF的表达,但抑制p21WAF1的表达。

子宫颈癌组织中p14ARF的表达及意义

目的探讨p14ARF在宫颈癌、上皮内瘤变(CIN)及正常宫颈组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组化SP法检测30例正常宫颈组织、20例CIN组织和52例子宫颈鳞癌组织中p14ARF的表达。结果在正常宫颈组织中p14ARF蛋白呈阴性表达;在CIN组织及宫颈癌组织中呈过表达,阳性率分别为30.0%(6/20)、63.5%(33/52)(P<0.05)。p14ARF蛋白在有淋巴转移宫颈癌组织中阳性表达率为85.0%,无淋巴转移者为50.0%(P<0.05)。p14ARF蛋白在组织分级G3期阳性率为90.9%与G1期(33.3%)相比,P<0.05。结论p14ARF的过表达发生在宫颈癌和癌前病变阶段,可作为一种肿瘤标记物用于宫颈癌的临床筛查及诊断。

甲状腺肿瘤p14^(ARF)、p53及FHIT蛋白的表达

目的探讨p14ARF、p53及FHIT蛋白在甲状腺肿瘤组织中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法检测20例甲状腺腺瘤和28例甲状腺癌组织中p14ARF、p53及FHIT蛋白的表达。结果p14ARF、p53及FHIT蛋白在甲状腺腺瘤和甲状腺癌中阳性率分别为90%、35.7%、15%和75%、90%、7.14%,3种蛋白在甲状腺腺瘤及甲状腺癌的表达差异均有显著性(P<0.05)。p14ARF、p53及FHIT蛋白的表达在甲状腺滤泡癌(FTC)与腺瘤之间,乳头状癌(PTC)与腺瘤之间差异均有显著性(P<0.05),p53及FHIT的表达在髓样癌(MTC)与腺瘤间差异也有显著性(P<0.05)。p14ARF、p53及FHIT蛋白的表达与甲状腺肿瘤的恶性进程有关,与患者年龄、性别及淋巴结转移无关。另外p14ARF与FHIT蛋白的表达呈正相关,并且它们与p53的表达均呈负相关。结论肿瘤抑制蛋白p14ARF和FHIT的缺失以及p53蛋白的高表达可能是甲状腺肿瘤发生的重要原因之一。联合检测p14ARF、p53及FHIT蛋白有助于区分甲状腺腺瘤和甲状腺滤泡癌。

p14^(ARF)、p53蛋白表达与H101治疗鼻咽癌疗效的关系

目的:观察肿瘤组织p14ARF、突变型p53蛋白表达状态与E1B缺陷型腺病毒治疗鼻咽癌疗效的关系,探讨E1B缺陷型腺病毒(简称H101)基因治疗的作用机制。方法:应用免疫组织化学方法对36例H101治疗的晚期鼻咽鳞癌病例进行肿瘤组织p14ARF、突变型p53蛋白检测,分析肿瘤组织p14ARF、突变型p53蛋白表达与H101临床疗效的关系;结果:突变型p53和p14ARF蛋白在36例晚期鼻咽鳞癌中总阳性表达率分别为55.6%和44.4%;突变型p53+p14ARF+(即p14ARF蛋白无缺失)患者均无治疗有效病例;突变型p53+p14ARF-(即p14ARF蛋白有缺失)患者中有4例有效;结论:对于p53基因无突变的恶性肿瘤,p14ARF基因缺失可能是H101能在肿瘤细胞内有效复制并杀死肿瘤细胞的一个重要影响因素。

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX-HTb,并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达;P14蛋白在BL21(DE3)pLysS中表达量较低,而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明,P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western-blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带,推测这两种蛋白可能存在构象表位。

P14(INK4a/ARF)蛋白在非小细胞肺癌组织中表达的意义

目的 检测非小细胞肺癌组织中P14蛋白的表达 ,研究其预后价值。方法 以P14抗体FL 13 2蛋白对 3 9例患者肺癌组织进行免疫组化染色。结果 3 9例患者中 2 5例 ( 64 .1% )P14蛋白表达阳性 ;临床Ⅰ～Ⅱ期患者的P14蛋白表达率显著高于Ⅲ～Ⅳ期患者 ( 78.0 %比 43 .8% ,P =0 .0 43 ) ;有、无远处转移患者的P14蛋白表达率分别为 78.3 %和 43 .8% ,P =0 .0 43 ;无P14蛋白表达者的 3年生存率明显低于有P14蛋白表达者 ,中位生存期分别为 17月和 45月 ,P =0 .0 2 3 5。结论 肺癌组织中P14蛋白表达阳性的患者有较好的预后 ,检测肺癌组织中P14蛋白表达有助于预测肺癌预后。

非小细胞肺癌p14^(ARF) p16^(INK4a)蛋白共表达及其临床意义

目的:探讨p14ARF、p16INK4a蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达、意义及相关关系。方法:采用免疫组织化学SP方法对103例NSCLC组织中p14ARF和p16INK4a蛋白的表达进行检测。结果:103例NSCLC组织中p14ARF、p16INK4a蛋白表达阴性率分别为70.87%和43.69%,差异有显著性(P<0.01)。其中35例p14ARF、p16INK4a蛋白表达共阴性,共阴性率达33.98%(35/103),鳞癌中共阴性率明显高于其它组织类型(P<0.01)。p14ARF、p16INK4a蛋白表达阴性相互间无显著相关性(P>0.05)。临床Ⅲ+Ⅳ期病例两种蛋白表达阴性率明显高于临床Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。结论:NSCLC组织p14ARF、p16INK4a蛋白表达共阴性具有明显的组织学类型特异性,两种蛋白阴性表达是各自独立的事件。

外阴鳞癌组织中p14^(ARF)表达与人乳头状瘤病毒感染状态关系的研究

目的:探讨p14ARF表达与不同HPV感染状态的外阴鳞癌发生和发展的关系。方法:采用RT-PCR和蛋白印迹技术检测42例外阴鳞癌组织、10例正常外阴组织中p14ARF基因mRNA及蛋白表达水平,PCR技术检测其HPV-DNA,分析HPV阳性组和阴性组外阴鳞癌组织中,p14ARF基因mRNA及蛋白表达与其临床病理特性的关系。结果:外阴鳞癌组p14ARF基因mRNA及蛋白表达强度为0.92±0.24和1.09±0.11;正常外阴组分别为0.93±0.06和1.02±0.38,两组比较差异无统计学意义,P>0.05;低、中和高分化鳞癌组p14ARF基因mRNA表达分别为0.98±0.11、0.94±0.15和0.91±0.07;p14ARF基因蛋白表达低、中和高分化分别为1.14±0.24、1.11±0.27和1.07±0.29,3组间比较差异均无统计学意义,P>0.05。p14ARF基因mRNA及蛋白在HPV阳性组表达强度分别为0.99±0.04和1.11±0.02,HPV阴性组表达强度分别为0.61±0.07和0.76±0.06,两组比较差异有统计学意义,P<0.05。结论:p14ARF可能参与了外阴鳞癌的发生发展过程,并可能成为HPV感染的外阴鳞癌发生进展相关的基因。

非小细胞肺癌中p14ARF和mtp53蛋白表达与临床病理参数的关系

目的探讨p14ARF和mtp53蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达与临床病理参数的关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测15例正常肺组织、18例癌旁组织和98例NSCLC组织标本中p14ARF和mtp53的表达。结果(1)在正常肺组织、癌旁组织和NSCLC中p14ARF蛋白的阳性表达率分别为93.3%、83.3%、55.1%,mtp53蛋白的阳性表达率分别为6.7%、44.4%、79.6%;p14ARF蛋白和mtp53蛋白在NSCLC中的表达与正常肺组织和癌旁组织比较均有显著性差异(P<0.01);p14ARF蛋白表达与临床病理分期、有无淋巴结转移、有无脉管浸润无关(P>0.05),而与病理分化程度有关(P<0.01);mtp53蛋白表达与临床病理分期、病理分化程度(P<0.01)及有无脉管浸润(P<0.05)有关,而与有无淋巴结转移无关(P>0.05);(2)在NSCLC中,pl4ARF与mtp53蛋白共表达为36.7%,一致性为38.8%,二者表达呈负相关(r=-0.3553,P<0.001)。结论p14ARF表达下调及mtp53表达上调在NSCLC的发生、发展中发挥着一定的作用;联合检测p14ARF和mtp53有助于判断NSCLC的分级和转移情况。

P14、P16在宫颈癌中的表达及临床意义

目的探讨P14、P16在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理参数的相关性。方法采用免疫组织化学链霉素抗生素一过氧化酶连接法（S-P法）检测P14、P16在56例宫颈鳞癌组织、20例CINⅢ组织和30例正常宫颈组织中的表达情况。结果P14和P16蛋白在正常宫颈组织中的阳性表达率明显低于CINⅢ组织和宫颈癌组织，差异有显著性（P〈0．05）。P14蛋白的表达与浸润深度、病理分级及淋巴转移有关（P〈0．05），与临床分期、年龄、肿瘤大小或脉管有无癌栓无关（P〉0．05）；P16蛋白的表达与病理分级及淋巴转移有关（P〈0．05），与临床分期、年龄、肿瘤大小、浸润深度或脉管有无癌栓无关（P〉0．05）。结论P14、P16基因的高表达发生在宫颈癌和癌前病变阶段，对宫颈癌的诊断及预后判断有一定价值，故可作为肿瘤标记物用于宫颈癌的临床筛查及诊断。

HCVC蛋白、p53、Mdm2、p14和p21在原发性肝癌中的表达及相关性

目的:研究原发性肝癌(HCC)组织中核心蛋白、突变p53、Mdm2、p14和p21的表达及其相关性,探讨HCV核心蛋白对突变p53、Mdm2、p14和p21表达影响及临床意义。方法:收集42例HCC石蜡组织,采用免疫组织化学EnVision法检测HCC组织中核心蛋白、突变p53、Mdm2、p14和p21的表达,用统计学方法及临床联系分析它们之间的关系。结果:核心蛋白、突变p53、Mdm2、p14和p21的阳性表达主要定位于细胞核中;HCC组织中核心蛋白、突变p53、Mdm2、p14和p21阳性率分别为40.5%、47.62%、75.57%、45.24%、19.05%;5组间的Kruskal-Wallis检验P=0.000,差异显著,核心蛋白与突变p53、Mdm2、p14和p21间的Mann-WhitneyU秩和检验P值分别为0.043、0.009、1.0、0.023;HCVC蛋白与突变p53、p14、p21阳性强度两者间相关性Spearman检验P值分别为0.000、0.000、0.43,相关系数rs分别为0.67、0.64、-0.29;p53和Mdm2、p21阳性强度间相关性Spearman检验p值为0.000、0.174,rs分别为0.72、-0.45。结论:在HCV感染的HCC中HCVC蛋白可能促进野生p53突变和表达,p14的表达与C蛋白有关联;突变p53和p14很可能促进Mdm2的表达;HCC中p21表达缺陷是十分常见的,HCV相关的HCC主要与p53通路改变有关,C蛋白可能下调p21的表达。因此,HCV相关的HCC中C蛋白、突变p53、Mdm2很可能促进肝细胞增生或恶性生长。

小细胞肺癌p14^(ARF)、p16^(INK4a)蛋白表达及其临床意义

目的 研究p14 ARF、p16INK4a蛋白在小细胞肺癌 (smallcelllungcancer ,SCLC)中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学S P方法检测 2 4例SCLC癌组织标本中两种蛋白表达。结果 2 4例标本中 ,15例p14 ARF蛋白表达阴性( 62 .5 0 %) ,4例p16INK4a蛋白表达阴性 ( 16.67%) ,3例p14 ARF、p16INK4a蛋白表达均阴性 ( 12 .5 0 %)。p14 ARF、p16INK4a蛋白阴性率均与患者性别、年龄、临床分期及淋巴结转移无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 SCLC中p14 ARF、p16INK4a蛋白表达阴性是各自独立的事件 ,可能与SCLC的发生有关 ,其中p14 ARF表达阴性占主要地位。

细胞周期抑制蛋白p14^(ARF)在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的 研究细胞周期抑制蛋白p14 ARF在非小细胞肺癌 (NSCLC)中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学S P方法检测 10 3例NSCLC癌组织标本中p14 ARF蛋白表达 ,同时以 2 0例肺部炎症病变组织作对照。结果 10 3例NSCLC标本中 ,p14 ARF阳性表达 3 0例 ,阴性表达 73例 ,表达阴性率为 70 .87%。不同类型NSCLC中p14 ARF表达不同 :鳞癌中p14 ARF表达阴性率较高 (88.2 4% ) ,肺泡癌中较低 (5 2 .78% ) ,腺癌介于两者之间 (72 .73 % ) ,各组织类型之间的差异有非常显著的意义 (P <0 .0 1)。临床Ⅲ +Ⅳ期病例p14 ARF蛋白表达阴性率为 78.5 7% ,明显高于临床Ⅰ +Ⅱ期 (5 4.0 5 % ) ,差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;男性患者癌组织中p14 ARF阴性率 81.94% (5 9/72 )明显高于女性 45 .16% (14 /3 1) ,差异有显著性意义 (P <0 .0 1)。结论 NSCLC组织p14 ARF蛋白表达异常具有明显的组织学类型特异性 ;p14 ARF蛋白表达异常在NSCLC发生、发展中起重要作用 ,有可能同时成为预测病程进展的指标之一。

p14^(ARF)和p53蛋白表达与脑胶质瘤发生发展的相关性研究

目的:探讨脑胶质瘤中p14ARF和p53蛋白表达与不同病理级别脑胶质瘤的相关性及两者之间的相互作用。方法:应用免疫组织化学技术检测31例不同病理分级脑胶质瘤中的上述遗传学改变,5例脑挫裂伤脑组织为正常对照。结果:p14ARF和p53蛋白在低级别(,级)和高级别(,级)脑胶质瘤中的表达阳性率分别为75.00%和30.43%,12.50%和69.57%。两蛋白在低级别和高级别中的表达差异均有显著性(P<0.05)。p14ARF表达水平与脑胶质瘤病理分级之间呈显著负相关性(r=-0.571,P<0.01),即随着肿瘤恶性度的升高而降低。而突变型p53蛋白正相反,与病理分级呈显著正相关性(r=0.472,P≤0.01),即随着肿瘤恶性度增高而增高。p14ARF和p53蛋白之间在肿瘤中存在明显的相互作用(P<0.05)。结论:p14ARF和p53蛋白表达异常可导致细胞周期调控失常和细胞异常增殖,并且二者之间存在协同作用,可加速脑胶质瘤恶性演进。

p14^(ARF)和p16^(INK4a)蛋白共表达状态对非小细胞肺癌术后放化疗及生存的影响

目的 探讨p14 ARF蛋白和p16 INK4a蛋白共表达状态对非小细胞肺癌 (NSCLC)术后放化疗及生存的影响。方法 选择经免疫组化SP法检测出的p14 ARF和p16 INK4a蛋白共表达阴性的NSCLC患者 35例 ,共表达阳性患者 2 0例 ,比较两组的临床病理特征并随访其术后放化疗情况和生存时间。结果 两组患者年龄、肿瘤分期、分化程度、术后复发转移及术后放化疗差异无统计学意义 (P >0 0 5 ) ,而性别、吸烟指数、组织学类型差异显著 (P <0 0 1) ;共表达阴性组患者术后 2、3年及总生存率较阳性组显著降低 (P <0 0 5 )。结论 p14 ARF和p16 INK4a蛋白共表达状态是影响NSCLC病人放化疗及远期生存的因素之一。

HCV核心蛋白,p53,Mdm2,p14^(ARF)在HCV肝炎肝硬化的表达及相关性

目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)肝炎、肝硬化组织核心蛋白、突变p53,Mdm2,p14ARF的表达以及它们间的相关性,探讨HCV核心蛋白对突变p53,Mdm2,p14ARF的表达作用及临床意义.方法:收集HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织23例,采用免疫组织化学EnVision法检测HCV感染的肝炎、肝硬化组织中核心蛋白、突变p53,Mdm2,p14ARF的表达,用统计学方法及临床联系分析它们之间的关系.结果:核心蛋白、突变p53、Mdm2,p14ARF的阳性表达主要定位于细胞核中;核心蛋白阳性表达的组织中突变p53,Mdm2、p14ARF阳性率分别为87%,91.3%,65.2%;4组间的KruskalWallis检验P<0.01,差异显著,核心蛋白与p53,p14ARF间的MannWhitneyU秩和检验P值分别为0.05,0.01;HCVC蛋白与突变p53,Mdm2,p14ARF阳性强度两者间相关性Spearman检验P值分别为0.01,0.067,0.72,相关系数rp分别为0.71,0.493,0.053.结论:HCV核心蛋白可能促进野生p53突变和表达,同时也可能间接促进Mdm2和p14ARF的表达;核心蛋白、突变p53,Mdm2的共同作用可促进肝细胞增殖、非典型性增生及其转化.

HCC和HepG2细胞表达HCVC蛋白、p14^(ARF)、p21^(WAF1)的意义探讨

目的检测HCVC蛋白、p14、p21在HCC和表达野生p53HepG2中的表达,初步探讨C蛋白在HCC和HepG2中对p14-p53-p21凋亡通路的作用。方法收集42例HCC石蜡组织,采用免疫组织化学EnVision法检测HCC组织中核心蛋白、p14和p21的表达,用统计学方法及临床联系分析它们之间的关系;用细胞化学EnVision法和免疫荧光法检测核心蛋白、p53、p14和p21在HepG2细胞中的表达。结果C蛋白、p14和p21的阳性表达主要定位于细胞核膜和细胞核中;HCC组织中C蛋白、p14和p21阳性率分别为40.5%、45.24%、19.05%;3组间的Kruskal-Wallis检验P=0.03,差异显著;C蛋白与p14、p21间及p14与p21间蛋白阳性强度相关性分析显示,P值分别为0.000、0.43、-0.34,相关系数rs分别为0.64、-0.29、-0.33。HepG2细胞有较高的C蛋白和p53表达及少量的p14、p21蛋白表达。结论在C蛋白阳性的HCC中p14的表达与C蛋白有关,HCC中p21表达缺陷是十分常见的;C蛋白在HCC中可能影响p53通路,下调p21的表达,阻止其凋亡作用;HepG2细胞永生化特性可能与HCV或HCVC蛋白有关。

发育不良痣皮损中P14^(ARF)/P16β和gp100的表达

目的:探讨P14ARF/P16β和gp100等在发育不良痣(DN)皮损中的表达。方法:应用免疫组化方法,分别对9例DN、10例先天性色痣和10例普通获得性痣的石蜡组织标本,进行P14ARF/P16β和gp100等的检测。结果:在P14ARF/P16β标记中,DN与先天性色痣或普通获得性痣相比呈现低表达。在gp100标记中,DN与先天性色痣或普通获得性痣相比呈现高表达。结论:DN与先天性色痣或普通获得性痣相比,其P14ARF/P16β表达降低,可能与痣细胞不成熟相关,而DN中的gp100高表达,提示与痣细胞增生活跃相关。