p16^INK4a蛋白在宫颈疾病中的表达特点及其与HPV感染的关系

目的研究伴有高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hr-HPV)感染及无hr-HPV感染的宫颈癌(cervical cancer,CC)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及宫颈炎中p16INK4a蛋白表达水平的变化及意义,探讨宫颈癌及癌前病变中p16INK4a蛋白表达与HPV感染的相关性。方法应用免疫组化方法检测126例宫颈疾病(CC40例,CIN67例和宫颈炎19例)组织中p16INK4a蛋白的表达,其中,hr-HPV(+)宫颈疾病89例(CC32例,CIN48例和宫颈炎9例),hr-HPV(-)宫颈疾病37例(CC8例,CIN19例和宫颈炎10例),进行半定量分析及统计学检验。结果40例CC中,p16INK4a全部阳性表达;48例hr-HPV(+)和19例hr-HPV(-)CIN中,p16INK4a阳性表达分别为39例和12例;9例hr-HPV(+)和10例hr-HPV(-)宫颈炎组织中,p16INK4a阳性表达均为4例。hr-HPV(+)或hr-HPV(-)宫颈炎、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中p16INK4a蛋白表达水平均依次升高。CC和CIN中p16INK4a蛋白表达与hr-HPV感染相互间无显著相关性(P>0.05)。结论细胞周期抑制蛋白p16INK4a在CC及癌前病变中过表达,且与hr-HPV感染无关,提示p16INK4a蛋白在宫颈癌的发生、发展中所起的作用和作用机制可能与其在其他恶性肿瘤中不同。检测p16INK4a蛋白表达有助于CC的早期诊断。

P16^INK4A基因对宫颈癌和癌前病变的诊断价值

目的探讨宫颈癌及癌前病变(CIN)组织中P16INK4A基因表达的临床意义及P16INK4A基因检测对宫颈癌及CIN的诊断价值。方法选取2004—2006年经病理检查证实的宫颈浸润癌患者18例、CIN患者150例和慢性宫颈炎患者57例,采用EnVision免疫组化法检测组织标本中P16INK4A阳性表达情况,并进行比较分析。结果CIN组和浸润癌组患者的P16INK4A阳性表达率与慢性宫颈炎组间差异均有统计学意义(P<0·01);随宫颈病变程度加重,P16INK4A的表达强度和阳性表达率不断升高(P<0·01)。结论P16INK4A基因表达与宫颈癌及CIN病变程度及其进展有关;P16INK4A基因可作为宫颈癌和CIN早期诊断、判断病情、预测病情进展和预后的生物学指标。

HPV16／18阳性的宫颈尖锐湿疣及癌前病变组织中NF-κBp50和P16^INK4A蛋白表达分析

[目的]探讨NF-κBp50和P16INK4A在HPV16/18型宫颈尖锐湿疣(condylomata acuminate CA)和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelinal neoplasin CIN)组织中的表达及意义。[方法]应用免疫组织化学LDP法对21例宫颈CA、34例宫颈CIN进行NF-κBp50和P16INK4A表达分析。[结果]NF-κBp50在CA组织中阳性表达于细胞浆,在CIN组织中阳性表达于细胞核,NF-κBp50在CA、CINⅠ、CINⅡ3组间阳性表达强度有统计学意义(P﹤0.05),P16INK4A在CA组织中阳性表达于细胞核,在CIN阳性表达于细胞核与细胞浆,P16INK4A在CA、CINⅠ、CINⅡ3组间阳性表达强度有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]HPV16/18阳性CA向CIN转化可能与P16INK4A和NF-κBp50蛋白过渡表达有关;其联合检测可作为辅助诊断CIN的标志物。

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16^INK4a启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967^-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.

核因子-κBp50和P16^INK4A在尖锐湿疣皮损中的表达及意义

尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的性传播疾病之一，最常见于HPV6、11型感染。国内外研究表明CA可发生癌变，因此尖锐湿疣与癌变的关系日益受到人们的关注。笔者通过免疫组化方法对尖锐湿疣组织中核因子（NF）-κBp50和P16^INK4A表达进行了研究，以便进一步了解尖锐湿疣的发病机制。

P16^INK4a蛋白表达调控机制及免疫组化染色结果判读

由CDKN2A基因(p16基因)编码的P16^INK4a(简称P16),又称CAKN2A(cyclin-dependent kinaseinhibitor 2A),MTS-1 (multiple tumor suppressor 1),INK4A(inhibitor of CDK4)等,是细胞周期G1/S期检查点(check point)的负性调节因子和重要的抑癌基因。P16-CDK4/6-cyclin D-pRb 通路调控异常则是引起G1/S转换导致肿瘤细胞过度增殖的重要机制。既往认为,编码P16INK4a 蛋白的CDKN2A基因的纯合性缺失(homozygous deletion)、杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)、点突变(point mutation)和启动子超甲基化(promoter hypermethylation)是肿瘤细胞周期异常的主要机制[1,2]。

p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil在不同年龄人角膜内皮细胞中的表达及其意义

背景p16^INK4a基因在细胞老化和早衰过程中发挥着重要作用，是目前已知的细胞衰老的主导基因。角膜内皮细胞（CECs）周期停滞于G。期且体内缺乏增生能力，是否与细胞衰老有关尚未得知。目的探讨不同年龄的正常人CECs中p16^INK4a基因及其抑制基因Bmil的表达。方法收集临床上DX液保存的行角膜移植手术后剩余的供体周边环状角膜组织，记录供体年龄。经锥虫蓝一茜素红双染法观察CECs的活性；行苏木精一伊红染色以证实角膜材料的组织结构正常。将收集到的角膜环材料按照年龄分为〈30岁组、30～50岁组和〉50岁组，每组30个角膜环，其中15个用于总RNA提取，另外15个角膜环等分为3份，分别用于免疫组织化学检测、免疫荧光检测和CECs活性的观察。提取每个角膜环的总RNA，行实时荧光定量PCR检测，观察p16^INK4amRNA、BmilmRNA和Ki67mRNA在CECs中的表达。行冰冻切片免疫组织化学染色，检测p16^INK4a、Bmil和Ki67蛋白在CECs中的表达。免疫荧光法检测p16”“。在CECs的表达。结果苏木精一伊红染色结果显示，供体角膜上皮、基质和内皮结构完整，排列规则。实时荧光定量PCR检测显示随年龄增长，p16^INK4a。mRNA的表达增强，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达减弱，差异均有统计学意义（F=5．703，P=0．014；F=3．950，P=0．042；F=548．500，P=0．000），其中与〈30岁组比较，〉50岁组p16^INK4amRNA在CECs中的表达量明显升高，而BmilmRNA和Ki67mRNA的表达均明显降低，差异均有统计学意义（P=0．006、0．013、0．000）。免疫组织化学结果可见，p16^INK4a。蛋白在各组CECs中均有表达，主要位于细胞核内，而Bmil与Ki67在年老供体的表达强度均弱于年轻供体，与实时荧光定量PCR的结果基本一致。免疫荧光染色显示，年老供体CECs p16^INK4a的表达强度强于年轻供体。结论细胞衰老主导基因p16^INK4a的表达随年龄增加而增高，其抑制基因Bmil的表达随年龄增加而降低。

良性前列腺增生组织中P16^ink4a与HST2 mRNA表达情况的初步探讨

目的:探讨衰老基因P16ink4a与长寿基因HST2在BPH组织中的表达。方法:对23例BPH及18例正常前列腺标本,提取总RNA后行RT-PCR,并对BPH、正常前列腺组织标本中HST2和P16ink4a基因表达进行定性及半定量分析。结果:正常前列腺组织与增生前列腺组织中均无HST2 mRNA表达,仅检测出P16ink4a mRNA的表达。半定量分析显示P16ink4a mRNA的表达在正常前列腺组织(0.4868±0.0545)明显高于BPH组织(0.2783±0.0268),差异有显著性(P<0.05)。结论:P16ink4a基因在BPH发病中可能有重要意义,可能是导致细胞衰老逃逸的因素之一。

抑癌基因P16^INK4A过表达在宫颈细胞学检查为非典型鳞状细胞-不能明确意义时的诊断价值

目的探讨P16INK4A过表达在宫颈细胞学检查为非典型鳞状细胞-不能明确意义(ASCUS)时的诊断价值。方法对2007年1月至11月在上海市第十人民医院妇科就诊的75例细胞学检查报告为ASCUS的妇女进行阴道镜评估与镜下活检,并同时进行液基薄层细胞学检查(thinprep cytology test,TCT)样本、活检组织样本的P16INK4A过表达检测和高危人乳头瘤病毒DNA(HPV-DNA)检测。结果75例ASCUS患者中宫颈上皮内瘤变(CIN)的发生率为59%,其中高度病变的发生率为21%。随着宫颈病变程度的加重,高危HPV与P16INK4A阳性率逐渐上升。P16INK4A免疫细胞化学及免疫组织化学染色结果一致。在良性反应性病变中,仅有1例检出P16INK4A过表达,而高危HPV阳性率为39%,两者差异有统计学意义(χ2=9.09,P<0.01)。P16INK4A过表达检测从ASCUS中检出高度病变的特异度(84.75%)和敏感度(93.75%)均高于高危人乳头瘤病毒DNA检测(分别为55.93%,87.50%),并且有更高的阴性预测值及阳性预测值。结论P16INK4A过表达与宫颈癌前病变密切相关。P16INK4A过表达检测是一种有效的ASCUS分流管理手段,较高危HPV-DNA检测能更好地提高CIN的检出率,剔除ASCUS中的良性病变,避免不必要的阴道镜检查及创伤性活检。

慢性乙型肝炎病毒感染与p16^INK4A基因启动子甲基化关系的研究

目的 探讨慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染对p16^INK4A基因启动子甲基化的影响及其在HBV相关肝细胞癌（HCC）形成中的作用。方法 选取23例HBV相关HCC癌及癌旁组织、25例慢性乙型肝炎肝穿刺组织，采用甲基化特异性PCR（MSP）检测p16^INK4A基因启动子的甲基化状态；免疫组化EnVision二步法测定肝组织内HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测肝组织HBVDNA含量；PCR扩增和直接测序检测HBVx基因变异。结果 癌组织p16^INK4A基因启动子甲基化阳性率（47．83％）明显高于癌旁组织（17．39％），慢性乙型肝炎患者p16^INK4A基因启动子甲基化阳性率（36．00％）与癌组织、癌旁组织差异无统计学意义。在癌旁组织和慢性乙型肝炎，p16^INK4A基因启动子甲基化者HBx蛋白表达中位数分别为3．000和0．250，明显高于非甲基化者（0．500和0．000），但在癌组织中，HBx蛋白的表达与p16^INK4A基因启动子甲基化状态无关。HBsAg、HBcAg、组织HBVDNA含量和x基因突变均与p16^INK4A基因启动子甲基化状态无关。结论 在癌前病变中，p16^INK4A基因启动子甲基化与HBx蛋白高表达有关，HBx蛋白可能通过诱导p16^INK4A基因启动子甲基化而使该抑癌基因失活，在HBV相关HCC形成中起重要作用。

银屑病患者皮损表皮p16^INK4a mRNA表达与启动子甲基化的相关性

银屑病斑块形成反映了角质形成细胞增殖和凋亡的异常，p16^INK4a作为一种重要的抗凋亡基因，其蛋白表达在银屑病患者皮损中异常，可能与银屑病斑块的形成有关!。

银屑病患者皮损p16^INK4a基因CpG甲基化位点和频度

目的研究皮损表皮p16^INK4a甲基化阳性的银屑病患者基因启动子区CpG甲基化的位点和频度。方法采集50例银屑病患者皮损处皮肤,分离表皮,提取DNA。采用甲基化特异性PCR和测序法检测p16^INK4a基因启动子区CpG甲基化的位点和频度。结果p16^INK4a基因启动子甲基化阳性的患者,约50%CpG发生甲基化,均出现于特定位点。结论p16^INK4a甲基化阳性银屑病患者p16INK4a基因启动子并非完全发生甲基化。

p16^INK4a在宫颈液基细胞学辅助筛查中的标记意义

目的评价p16^INK4a在宫颈液基细胞学检查中的标记意义。方法收集74例宫颈外口和颈管的脱落细胞标本，分别进行液基细胞学检测和p16^INK4a免疫细胞化学染色，并应用杂交捕获二代法检测高危人乳头瘤病毒（HR—HPV）感染。结果74例标本中，细胞学诊断未见癌细胞或癌前病变细胞（阴性）10例，意义不明的不典型鳞状细胞（ASC—US）15例，鳞状上皮内低度病变（LSIL）28例，不除外上皮内高度病变的不典型鳞状细胞（ASC—H）5例，鳞状上皮内高度病变（HSIL）11例，鳞状细胞癌（SCC）5例。各级别病变中，HR—HPV阳性者分别为1、4、3、9、7和5例，p16^INK4a免疫细胞化学染色阳性者分别为2、5、3、8、9和5例。随着宫颈病变级别的上升，HR—HPV和p16^INK4a免疫细胞化学染色阳性率均增高。结论p16^INK4a免疫细胞化学染色增强了对不典型细胞的区分能力，可以提高宫颈癌筛查的准确性。

角质形成细胞增生行为与p16^(INK4a)蛋白表达和基因失活的相关性研究

目的:探讨角质形成细胞(KC)增生行为与p16INK4a蛋白表达及其基因失活的相关性。方法:对20例皮肤鳞状细胞癌、24例基底细胞癌、18例Bowen病、12例光线性角化病以及8例脂溢性角化病共计82例患者中具不同增生行为的KC,分别应用免疫组化检测其p16INK4a蛋白表达;应用聚合酶链反应(PCR)、PCR-单链构象多态性以及PCR-限制性内切酶分析方法分别检测p16INK4a基因外显子1和外显子2的缺失、突变和甲基化。结果:p16INK4a蛋白表达的阳性率和表达强度随着KC恶性程度的增加而降低,基因缺失和甲基化是皮肤癌p16INK4a基因失活的主要方式,p16INK4a蛋白失表达与其基因失活是一致的。结论:p16INK4a基因失活在KC恶性转化中起重要作用;p16INK4a基因有可能成为皮肤癌诊断与治疗的一种新靶位。

p16^INK4a与HPV感染相关疾病

p16是抑制CDK4和6的肿瘤抑制蛋白。高危型HPV中的致癌基因E7可使p16^INK4a失去pRb的反馈性抑制而过度表达且功能异常。低危型HPV感染相关的尖锐湿疣中p16^INK4a免疫活性表现为离散、点状分布的阳性。中高危HPV感染相关的鲍恩样丘疹病中p16^INK4a免疫活性表现为弥漫强阳性。p16^INK4a较HPV型别能更客观地推测尖锐湿疣、鲍恩样丘疹病恶变的可能。

高危型HPV负荷量与宫颈上皮内瘤样变级别、Ki-67和P16^(ink4a)表达的关系及随访观察

背景与目的:高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌的主要致病原因。HPV负荷量与宫颈癌的关系存在争论,其与肿瘤标记物的关系研究很少。本研究旨在初步探讨高危型HPV负荷量与宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)级别、Ki-67和p16ink4a表达及术后再次出现细胞学异常之间的关系。方法:选择61例CIN患者宫颈组织石蜡标本(CINⅠ8例、CINⅡ12例、CINⅢ41例),免疫组化检测Ki-67、p16ink4a表达。所有患者术前均用第二代杂交捕获法(hybridcaptureⅡ,HCⅡ)检测HPV负荷量,术后进行随访。结果:高危型HPV负荷量与CIN等级、Ki-67和p16ink4a表达之间呈等级正相关(r分别为0.288、0.318、0.336,P<0.05)。经过平均18.5个月的随访,发现6例患者再次出现宫颈脱落细胞学异常,其中5例术前HPV负荷量≥100RLU/PC、<1000RLU/PC,1例≥1000RLU/PC,但术前HPV负荷量与术后再次出现细胞学异常无关(P>0.05)。年龄、产次、组织学诊断、Ki-67与p16ink4a表达强度亦与术后细胞学异常无关。结论:HPV负荷量与CIN进展、细胞恶性程度增高呈正相关。尽管HPV负荷量与术后再次出现细胞学异常无关,但对病毒负荷量>100RLU/PC的患者仍应严密随访。

宫颈上皮内瘤变中p16^(INK4A)和Ki-67的表达

目的探讨p16INK4A、Ki-67和HPV抗原表达及高危型HPV(HR-HPV)检测在宫颈上皮内瘤变(CIN)病理诊断中的意义。方法选取宫颈活检病理确诊为CIN的组织蜡块101例,重新切片,应用免疫组化两步法检测p16INK4A、Ki-67和HPV抗原表达,并取正常宫颈组织50例进行对比研究。同时,应用第二代杂交捕获法对其中25例CIN组织样品进行HR-HPV检测。结果p16INK4A蛋白表达水平在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ级之间差异有非常显著性(P<0.001),其表达水平随着CIN级别的增高而增加,呈现良好的线性相关性(P<0.001);Ki-67蛋白表达阳性细胞多少与CIN分级之间无显著相关性(P>0.05),但其在宫颈鳞状上皮中的位置分布与CIN级别之间却有显著相关性(P<0.05);HPV抗原免疫组化染色阳性反应仅呈现于CIN鳞状上皮表层挖空细胞内,其阳性率在不同级别CIN之间的差异无统计学意义(P>0.05);HR-HPV在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ级的检出率分别为81.8%、80.0%和100.0%,但其检出率在不同级别CIN之间差异也无显著性(P>0.05)。结论p16INK4A和Ki-67染色对CIN的病理诊断和分级具有一定诊断价值,对于CINⅠ级形态结构不典型的病例,HR-HPV的检测结果对病理诊断有辅助意义。

P16^(ink4)cDNA的克隆及序列分析

Ｐ１６ｉｎｋ４ｃＤＮＡ的克隆及序列分析黄长晖邓炜傅继梁（第二军医大学生物教研室，医学分子遗传学开放实验室上海２００４３３）（复旦大学遗传学研究所上海２００４３３）Ｐ１６ｉｎｋ４是ＣＤＫ（ＣｙｃｌｉｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＫｉｎａｓｅ）抑制蛋白家族中的...