非洲猪瘟病毒p17蛋白的哺乳动物细胞表达及鉴定

研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示:本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。

禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定

禽呼肠孤病毒(ARV)p17蛋白在诱导细胞自噬和促进病毒复制中发挥重要作用,但与宿主细胞之间的相互关系及其致病机制尚不清楚。本研究将ARV GX/2010/1株病毒液以10^(4.3)TCID50/0.2 mL通过滴鼻点眼注射感染7日龄SPF鸡。应用Smart^(TM)技术构建该鸡肝组织cDNA文库,且文库滴度达到2.6×10^(7)CFU/mL。以p17为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选得到16个互作候选克隆,经酵母回复验证得到9个阳性克隆并送至测序。通过NCBI和Uniport等在线数据库比对分析得到PRPS2、IFI16、GTPBP4、IGF2BP1等胞内互作蛋白。基因功能分析显示,这些蛋白参与宿主细胞先天免疫反应、RNA的运输与翻译、结合核糖蛋白复合物、细胞粘附与迁移等生物学过程。对这些互作蛋白的深入研究将为进一步了解ARV及其p17蛋白致病的分子机制奠定基础。

禽呼肠孤病毒分离株P10、P17、δ3蛋白基因的表达及抗血清的制备

禽呼肠孤病毒的感染在我国鸡群中非常普遍，它除了可引起鸡传染性关节炎外，还可能引起矮小综合症和免疫抑制等。从鸡群中分离到的不同毒株ARV的毒力差别较大，抗原性也不尽相同。ARV是一种双股RNA病毒，病毒颗粒中的基因组有10个不同的独立节段组成。

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。

禽呼肠孤病毒σNS和P17非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究

表达并纯化了禽呼肠孤病毒(ARV)的2个非结构蛋白σNS和P17,并以此作为包被用抗原,分别进行间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度分别为9.3μg/mL和11.5μg/mL;一抗血清的稀释度都是1∶200;HRP酶标二抗羊抗鸡IgG稀释度为1∶5 000,初步建立了能检测ARV感染的σNS-ELISA、P17-ELISA方法。以σNS、P17两种蛋白按以上确定的条件同时包被,建立了σNS-P17-ELISA。分别用σNS-ELISA、P17-ELISA及σNS-P17-ELISA对接种过ARV活病毒或灭活疫苗的33份SPF鸡血清进行检测,结果发现以非结构蛋白建立的3种ELISA方法均能区分ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的抗体,进一步对这3种方法进行敏感性、特异性分析比较,表明σNS-P17-ELISA方法能更有效地区分ARV感染与灭活疫苗免疫抗体。

非洲猪瘟病毒p17蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫学诊断试剂,利用杆状病毒表达系统表达了重组ASFV p17蛋白并纯化,然后将其免疫BALB/c小鼠,之后将高血清抗体效价小鼠的脾细胞融合骨髓瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,筛选到16株能稳定分泌抗p17蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的效价均介于1∶2.560×106~1∶1.024×107。抗体亚类鉴定结果显示,6株单克隆抗体(6H6、4D1、7E8、3D1、2F4和2B4)的重链亚类均为IgG1,其余10株单克隆抗体(7H12、10H6、10F3、6E11、4B3、5F7、7H9、6C4、2F1和4H7)的重链亚类均为IgG2a,所有单克隆抗体的轻链亚类均为κ链;IFA鉴定结果表明,共有8株单克隆抗体可特异性识别ASFV。综上,成功制备了ASFV p17蛋白单克隆抗体。

首例中国大陆居民艾滋病尸检病例的免疫组化检测

采用免疫组织化学方法对首例中国大陆居民艾滋病尸检病例的脑、肝、肾、心、肺、胰、肠、脾、胸腺、淋巴结和阑尾等组织标本进行了HIV-1gp_(120)和P_(17)抗原检测。结果证实,在脑组织神经胶质细胞和星形细胞、肠上皮细胞、肾小球毛细血管内皮细胞以及淋巴结、脾和胸腺的单核细胞均存有HIV-1抗原。

基质蛋白p17在人类免疫缺陷病毒感染及相关性疾病作用中的研究进展

基质蛋白p17是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的一种结构蛋白,不仅在HIV生命周期的多个阶段起着关键作用,还与HIV相关淋巴瘤、神经认知障碍和乳腺癌的发生有着密切关系。本文就基质蛋白p17在HIV感染及相关性疾病中的作用进行综述。

非洲猪瘟病毒内囊膜蛋白p17与宿主互作蛋白的初步鉴定

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的感染导致猪的死亡率高达100%,给养猪业造成毁灭性灾难。因此,开展针对ASFV感染复制的研究有着重大的意义。目前发现ASFV有超过150个开放阅读框,其中D117L基因编码的内囊膜蛋白p17参与病毒二十面体结构的形成,但是对p17调控宿主细胞功能的机制知之甚少。研究通过免疫沉淀技术联合蛋白质谱分析,初步筛选出与ASFV p17潜在的宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀技术和激光共聚焦实验确认了p17与线粒体外膜蛋白TOMM70(translocase of outer mitochondrial membrane 70)、热休克蛋白HSPA8(heat shock 70 kDa protein 8)的互作。该研究为进一步探索p17在ASFV感染过程中的功能提供了重要信息。

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。